從活腦中提取神經遞質- HPLC-MS / MS方法

2020-12-05 儀器信息網

神經遞質，大腦中在突觸傳遞中擔當「信使」的特定化學物質，稱作神經遞質，簡稱遞質。圖1、圖2為其示意圖。隨著神經生物學的發展，陸續在神經系統中發現了大量神經活性物質。在中樞神經系統（CNS）中，突觸傳遞最重要的方式是神經化學傳遞。神經遞質由突觸前膜釋放後立即與相應的突觸後膜受體結合，產生突觸去極化電位或超極化電位，導致突觸後神經興奮性升高或降低。神經遞質組成複雜，包括多種生化物質。

圖1 神經遞質示意圖

圖2 大腦中的「神經遞質」，黑質就被稱為「神經遞質」

要對神經遞質進行分析，必須首先從活腦中提取神經遞質，然後用HPLC-MS / MS進行分析，這實在有點匪夷所思，令人難以置信。然而，加拿大滑鐵盧大學雅努什·波利西恩（Janusz Pawliszyn）領導的團隊成功了。

從活腦中提取神經遞質，本質上是侵入性的。但是，他們通過利用固相微萃取（SPME）技術，已設法使其成為非侵入性的。他們的方法是將塗有某種形式的吸收性SPME材料的細不鏽鋼絲插入活體的大腦中。由於鋼絲較細，對大腦造成的幹擾較小，雅努什的團隊使用150μm粗的不鏽鋼絲。他們首先用酸蝕刻了不鏽鋼絲的下端部分，直到它只有100μm粗。然後，他們將SPME塗在蝕刻部分，將其直徑又增加至150μm。最後，又在塗層部分再添加了50μm厚的覆蓋層。

該團隊在特製的神經遞質混合物（包括去甲腎上腺素，乙醯膽鹼和5-羥色胺）上測試了各種不同的市售聚合物SPME材料，但沒有一種被證明是理想的。問題在於性能最好的SPME材料是以相對較大的顆粒形式出現的，尺寸可達60μm，需要將其研磨成細粉末塗在鋼絲上。但這種研磨導致材料失去了一些官能團，使其在吸收神經遞質方面的效率降低。

所以波利西恩和他的團隊選擇使用來自沃特世的一種名為HLB（親水 - 親脂平衡）的SPME材料，這種材料在吸收神經遞質方面不如其他一些材料有效，但其顆粒直徑卻只有5μm，可直接應用於鋼絲。然後，他們在顆粒表面添加了強陽離子交換（SCX）基團，提高了材料對神經遞質的有效性。在吸收神經遞質混合物方面時，HLB-SCX材料被證明優於任何其他測試的SPME材料。

SPME材料確定後，他們用提取的腦組織和瓊脂凝膠的混合物製成了人造大腦材料，以方便研究。在人造大腦材料中，加入了另一種神經遞質混合物。他們發現，將HLB-SCX塗層的鋼絲插入人造大腦，20min後，足以使HLB-SCX材料吸收令人滿意的神經遞質。將HLB-SCX塗層的鋼絲取出，浸泡在水、乙腈和甲醇的混合物中，釋放神經遞質，然後以高效液相色譜 - 串聯質譜（HPLC-MS / MS）儀進行分析。

實驗表明HLB-SCX材料可以從腦材料中提取幾種加標的神經遞質，包括去甲腎上腺素、乙醯膽鹼和5-羥色胺，用於通過HPLC-MS / MS在低於生理水平進行鑑定。然而，其他神經遞質，包括牛磺酸，穀氨酸和γ-氨基丁酸，只能在高於正常生理水平的濃度下檢測到。

最後，他們在活恆河猴獼猴的大腦上測試了他們的SPME方法。這包括在三個不同的場合同時將HLB-SCX塗層的鋼絲插入猴腦的三個不同區域。當科學家用HPLC-MS / MS分析提取的物質時，能夠檢測到多種不同的神經遞質，包括多巴胺、穀氨酸和色氨酸。他們用人工腦材料進行測試，甚至能夠檢測到牛磺酸，這是用生理檢測方法檢測不到的。他們還測量了大腦不同區域的不同濃度的神經遞質，其中，在某區域發現的神經遞質，在其它區域可能根本沒有發現，即使在同一區域內，場合不同其神經遞質也不同。

在此成功之後，波利西恩及其團隊正在計劃使用他們的SPME方法對活恆河猴獼猴大腦中神經遞質的分布進行詳細研究。他們還在考慮進一步提高方法提取效率的方法，以便它可以解釋可能存在的所有神經遞質。

（編譯：符斌 北京中實國金國際實驗室能力驗證研究中心研究員）

根據Brain extraction: A novel method for extracting neurotransmitters from live brains編寫

Published: Apr 15, 2019

Author: Jon Evans

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