微生物研究領域在過去的幾十年裡發展迅速，已經成為一個重大的科學和公眾利益的話題。然而我們對「微生物組」一詞缺乏一個公認的明確定義。
近日，奧地利格萊茲科技大學Gabriele Berg教授和亥姆霍茲慕尼黑中心Schloter教授究國際專家組成的小組會議討論關於微生物和微生物組到最新的技術發展和研究結果，明確區分了「微生物群」和「微生物組」兩個術語，並就微生物群的組成、微生物群在時間和空間上的異質性和動態性、微生物網絡的穩定性和恢復力、核心微生物群的定義進行了全面的討論，以及功能相關的關鍵物種以及微生物宿主和微生物群落內物種間相互作用的共同進化原理。
這些寬泛的定義以及所建議的統一概念將有助於今後改進微生物組研究的標準化，並可能成為綜合評估數據的起點，從而使知識從基礎科學更快地轉移到實踐中。此外，微生物組標準對於解決與地球健康領域人為驅動的變化相關的新挑戰非常重要，對微生物組的理解可能會起到關鍵作用。
本文是基於2019年3月6日在奧地利圖爾恩舉行的研討會的討論而形成的，該研討會是Microbiome Support項目的一部分，該項目旨在建立國際研究標準。
研討會匯集了來自學術，政府和行業團體的領先微生物組研究人員，他們代表了不同領域的專業知識。 在研討會之前，通過發送在線調查問卷，收集了來自世界100多位專家的建議。調查的結果和隨後的研討會討論構成了術語「微生物組」的擬議定義的基礎，此處介紹了包含微生物組研究規則和基準修訂。
01
從微生物到微生物群落的歷史
許多技術發明推動了微生物的研究，導致我們對健康和疾病的理解發生了範式轉變。
圖1 歷史回顧
顯微鏡的發明，讓我們得以發現一個全新的未知的微生物世界。
羅伯特·科赫（Robert Koch）對由於微生物感染而導致的人類和動物疾病起源的解釋以及病原性概念的發展是微生物學的重要裡程碑。
DNA的發現，測序技術，PCR和克隆技術的發展使人們能夠使用與培養無關，而是基於DNA和RNA的方法研究微生物群落。
這些新的可能性徹底改變了微生物生態學，因為以高通量的方式進行基因組和宏基因組分析提供了有效的方法來解決單個微生物以及整個自然棲息地中整個群落的功能潛能。
多項綜述已強調了結合多種「組學」技術分析宿主微生物相互作用的巨大潛力和巨大潛力。
02
微生物組定義
通常將微生物群落定義為生活在一起的微生物的集合。更具體地說，微生物群落被定義為多物種集合，其中（微生物）有機體在連續的環境中彼此相互作用。
微生物組的首次定義
1988年，Whipps及其同事研究了根際微生物的生態學，首次定義了微生物組。他們將「微生物組」描述為「微生物」和「生物組」的組合，並在「具有明確的理化特性的合理定義的棲息地」中將「特徵微生物群落」命名為「活動劇場」。
該定義代表了微生物群落定義的實質性進步，因為它定義了具有不同特性和功能的微生物群落及其與環境的相互作用，從而形成了特定的生態位。
微生物組的常用定義
但是，在過去的幾十年中，還發布了許多其他的微生物組定義。當前最常引用的定義是Lederberg將生態環境中的微生物群落描述為生物體空間或其他環境中的共棲，共生和致病微生物群落。
Marchesi和Ravel集中在對特定環境下的基因組、微生物(和病毒)基因表達模式和蛋白質組以及生物和非生物條件的定義。所有這些定義暗示著宏觀生態學的一般概念可以很容易地應用於微生物-微生物以及微生物與宿主的相互作用。
然而，這些為大型真核生物開發的概念在多大程度上可應用於原核生物，這些原核生物具有不同的生活方式，如休眠，表型變異和水平基因轉移以及目前尚不清楚的微型真核生物。這就提出了一個挑戰，即要考慮一種全新的微生物組生態學概念生態模型和理論體系，特別是在微生物相互之間以及與宿主生物和非生物環境相互作用的不同層次上。
許多當前的定義未能捕捉到這種複雜性，並且將術語「微生物組」描述為僅涵蓋微生物的基因組（下表）。 例如，Merriam Webster發布平臺提出了兩種微生物組定義：一種描述宏基因組，另一種是微生物群落，但仍然無法將宿主和環境作為微生物組的整體生態成分而不是一個獨立的實體來捕獲。
表1 微生物組的定義
修訂後的概念框架將使我們能夠從對微生物分類的方法轉變為更全面的微生物功能及其與環境相互作用的觀點。
然而，這將需要跨不同領域工作的科學家之間更多的跨學科互動。關於微生物組的各種觀點是Microbiome Support研討會中討論的中心部分。
根據在線調查和研討會討論中獲得的答覆，參與者得出的結論是Whipps等人的原始定義仍然是最全面的，它描述了微生物組的複雜性及其生態學和進化生物學的各個方面。 研討會的參與者討論了許多關鍵點，並提出了一些建議，以澄清和修正原始的Whipps和同事的定義。
這些修正案涉及（1）微生物組的成員，（2）微生物組的成員之間以及現有微生物網絡內部的相互作用，（3）環境中微生物群落的時空特徵，（4）核心微生物群，（5）從功能預測到物種表型，以及（6）微生物組-宿主或環境相互作用和協同進化。 下面將詳細討論這些方面。
03
微生物組成員
微生物群包括形成微生物組的所有活的成員。 下表解釋了這兩個詞源的詞源學和差異。細菌，古細菌，真菌，藻類和小的原生生物應被視為微生物組的成員。大多數微生物組研究人員都同意這一定義。
表2 微生物組/微生物群詞源
噬菌體，病毒，質粒和移動遺傳元件的整合是微生物組定義中最具爭議的問題之一。 參與者在「微生物組定義」在線調查中的評論也證實了這一點。 受訪者對病毒和噬菌體是否應屬於微生物組這一問題的回答沒有給出明確的答案，並且從「無論如何」延伸到「絕對沒有」。
關於來源於死細胞的細胞外DNA（所謂的「遺留DNA」）是否屬於微生物組還沒有明確的共識。在更廣泛的生境分析中，殘留DNA最多可佔土壤中測序DNA的40％，平均佔細菌總DNA的33％，在某些樣品中最高比例為80％。
有意思的是，儘管它非常豐富且無處不在，但遺留DNA對分類學和系統發育多樣性的估計影響很小。 當使用特定術語時，微生物組和微生物群之間的清晰區分有助於避免有關微生物組成員的爭議（下圖）。微生物群通常被定義為存在於特定環境中的活微生物的集合。由於噬菌體，病毒，質粒，病毒，類病毒和游離DNA通常不被視為活微生物，因此它們不屬於微生物群。
圖2 強調微生物組（微生物群落）及其「活動區」組成的示意圖
最初由Whipps及其同事提出的微生物組一詞不僅包括微生物群落，還包括微生物的「活動區」。後者涉及微生物產生的所有分子，包括其結構元素（核酸、蛋白質、脂類、多糖）、代謝物（信號分子、毒素、有機和無機分子），以及共存宿主產生的並由周圍環境條件構成的分子。因此，「微生物組」術語應包括所有可移動的遺傳元件，例如噬菌體，病毒，「遺物」和細胞外DNA，但不屬於微生物群（上圖）。
此外，在這方面，重要的是要考慮方法方面的差異，以區分DNA與活生物體及其環境（請參閱技術標準章節）。術語微生物組有時也與宏基因組混淆。 然而，宏基因組被明確定義為來自微生物群成員的基因組和基因的集合。
微生物組研究有時關注特定微生物群的行為，通常與明確的假設有關或由其明確證明。雖然越來越多的術語如「細菌組」，「古細菌組」，「黴菌組」或「病毒組」在科學文獻中開始出現，但這些術語並非指生物群落（一個具有獨特的（微生物）集合的區域生態系統，而物理環境往往反映一定的氣候和土壤）作為微生物群本身。因此，最好使用原始術語（細菌，古細菌或真菌群落）。
與可以單獨研究的微生物群落相反，微生物組始終由所有成員組成，這些成員彼此相互作用，生活在相同的棲息地，並共同形成其生態位。
公認的術語「病毒組」衍生自「病毒」和「基因組」，用於描述由一系列與特定生態系統或全生命周期相關的核酸組成的病毒Shotgun基因組。但是，這裡也可以將「病毒基因組」作為語義和科學上更好的術語來建議。
每個微生物組成員應以何種解析度進行研究？
對於真核生物，在大多數情況下，「生殖單位」是一個適當的水平，可以測量生物的動態，儘管物種定義仍在爭論中。
但是，對於原核生物，尚不存在基於繁殖的定義：當前的物種定義基於生物之間的DNA同源性，例如DNA-DNA雜交揭示的「 70％以上的DNA相似性」或根據Goris及其同事的建議。 與真核生物相似，微生物菌株或生態型是分類和功能的基礎。 此處定義的菌株的穩定性是最關鍵討論的問題，主要是由於水平基因轉移（HGT）的頻繁發生。
後者是由諸如質粒，噬菌體和轉座子之類的可移動遺傳元件從一種菌株轉移到另一種菌株而引起的，導致不可避免的基因組變化並嚴重影響菌株的穩定性。然而，由於微生物菌株之間的本質功能差異，忽略菌株水平可能會導致對數據的誤解。
在微生物菌株中定義具有生態意義的種群對於確定其在環境微生物和與宿主相關的微生物群落中的作用很重要。
最近，作為一種解決方案，引入了一種新的衡量最近基因流量的指標，該方法可確定與近親相鄰的，被強基因流不連續性隔開的一致的遺傳和生態單位。
04
微生物網絡和相互作用
微生物彼此相互作用，這些共生相互作用對微生物組內的微生物適應性，種群動態和功能能力具有不同的影響。這些相互作用可以在相同物種的微生物之間，也可以在不同物種，屬，科和生命域之間。
這些網絡中的交互模式可以是積極的（互惠的、協同的或共棲的）、消極的（偏害共棲[包括捕食、寄生、對抗或競爭]）或中性的，即對相互作用物種的功能能力或適應性沒有（或沒有觀察到）影響。
微生物生命策略的概念可以影響相互作用的結果。 例如，爭奪相同來源的微生物在不同營養水平爭奪相同化合物時也可以從彼此受益。 複雜微生物生態系統的穩定性取決於同一底物在不同濃度水平下的營養相互作用。
重要的是要強調指出，到目前為止，人們對自然界中微生物社會適應的研究還不夠。在這裡，分子標記可以通過支持自然微生物群系中利他主義者和作弊者等理論來提供社會適應的見解。
次生代謝產物在介導複雜的種間相互作用並確保競爭環境中的生存中起著至關重要的作用。群體感應（QC）, 由小分子（如N-醯基高絲氨酸內酯或肽）誘導的細菌誘導細菌控制合作活動，並使它們的表型適應生物環境，從而導致例如細胞間粘附或生物膜形成。
直接種間電子轉移（DIET）是大多數厭氧生態系統中交流的重要機制。此外，揮發性化合物還可以作為長距離信使，實現長距離跨界交流。
此外，所謂的「真菌高速公路」是細菌以及水和養分的運輸系統，因此可以在構建微生物網絡中發揮重要作用。
儘管有這些例子，但微生物組內的交流和相互作用仍未得到充分研究，將從對所有微生物組成員的代謝相互作用的更多了解中受益。在這裡，還原論實驗模型和微生物組模型可以幫助鑑定參與複雜相互作用的微生物和分子機制。
細菌的群體行為調控機制
群體效應(Quorum sensing) 是近來日益受到廣泛關注的一種細菌群體行為調控機制, 很多細菌有這種能力, 即分泌一種或多種自誘導劑(Autoinducer) , 細菌通過感應這些自誘導劑來判斷菌群密度和周圍環境變化, 當菌群數達到一定的閥值(quorum , 菌落或集落數) 後, 啟動相應一系列基因的調節表達, 以調節菌體的群體行為。
不同類型的細菌具有不同的群體效應調節系統, 很多細菌分泌同一種誘導劑, 以此調控不同種類細菌間的作用行為。群體效應系統在自誘導劑與受體之間存在專一性, 同時又在調節基因和信號傳遞系統中體現出多樣性和複雜性。由於不少人或植物的病原菌的致病機制等受群體效應的調控, 該機制已成為醫學等領域的研究熱點。
圖3 通過微生物共生網絡可視化微生物相互作用
生物信息網絡和共現分析給出了關於微生物相互作用模式的複雜性的想法，但它們不適合揭示這些相互作用的性質（上圖b）。 儘管存在這一限制，但對微生物網絡的分析仍使研究人員能夠識別中心物種，並探索微生物組內各種類型的物種相互作用的潛力。在微生物共生網絡中，中樞物種以與其他物種的連接程度最高的節點（上圖b）為代表。
共現分析也可以在不同的規模上應用，例如，群落規模的生態系統之間的共現模式，群落內共生微生物的模塊以及嵌套在微生物群落內的模塊內共生對。
它們可以與定植抗性聯繫起來，這決定了異源微生物入侵本地群落的潛力，並且可以被認為是產生假說的重要工具。 但是，特定類型的微生物相互作用的存在及其對種群動態或功能的後果，需要在相關的模型系統中進行測試（上圖c）。
此外，技術方法，如使用穩定同位素的交叉餵養實驗或螢光原位雜交和共焦雷射掃描顯微鏡（FISH-CLSM）與雙重培養分析相結合，對於檢驗在矽膠中產生的假設非常有用。
微生物相互作用可能是微生物群落內部進化和共同進化動力學的重要基礎
微生物群落成員之間的交流產生了一個複雜的景觀，其中細胞的適應性或功能不僅取決於單個細胞的遺傳潛能和化學環境，還取決於感測到的生物環境。 網絡中的中心物種通常被假設為關鍵物種，這一概念已從宏觀生態學轉移到微生物組學研究中。
與其他物種相比，基石物種在各種物種相互作用中起著至關重要的作用，並且對生態系統的性能和動態影響更大。 但是，共同關聯網絡中的樞紐物種不一定充當基石物種。 後者的特徵還必須通過適當的方法加以確認和補充。
樞紐和基石分類單元絕對需要對它們的功能有更好的了解; 此外，它們可以集成到計算方法中以聯繫微觀和宏觀生態學問題。 如果可以將關鍵物種視為「指示分類群」，那麼另一個術語（已被定義為高度指示特定實驗處理或環境條件的那些類群）仍不清楚。
指示分類群的概念從實踐的角度引起了人們的極大興趣，並從宏觀生態學轉移到了微生物組研究中，現在被廣泛使用，例如，用於評估農業實踐對微生物群落的影響或疾病對微生物的影響的研究。 人類微生物群； 如此處所示，可以使用簡單且高度標準化的基於qPCR的方法進行分析。
05
考慮微生物群落的時間和空間變化
微生物群落的時間和空間結構問題對於總體上了解微生物組的功能很重要。對於理解特定過程，例如在生物技術和食品加工應用中病原體的暴發，以及預測和控制微生物群落，它也具有重要意義。總的來說，最初針對大型生物描述的大小多樣性關係也被證明存在於各種生態系統中的微生物群落中。
微生物組內的時間動態可以從秒或分鐘的尺度進行評估，這反映了信使RNA的時間跨度到幾個世紀和一千年的尺度，在此期間微生物與其宿主或在特定環境中共同進化。細菌mRNA的半衰期取決於轉錄的基因，但通常在數分鐘的範圍內，而古細菌基因的轉錄本較長，並且已報導了數小時的時間。
重要的是，儘管過去許多作者將微生物活性與rRNA含量聯繫在一起，但最近的研究表明該概念存在嚴重局限性，只有mRNA可被視為代謝狀態的可靠指標。 在這一時間尺度範圍內理解研究的適當維度對於任何微生物組的操作都是至關重要的，例如在人類微生物組研究中的治療策略或在環境研究中使用生防製劑。仔細考慮感興趣宿主的具體特徵，例如晝夜節律，季節性變化或與宿主生物的生理學相關的生長階段，可能有助於確定評估時間動態的最佳尺度。
圖4 微生物群在時間和尺度上的動態變化
Stegen等建議考慮三類：（i）生物和非生物歷史，（ii）內部動力學，和（iii）外部強迫因素作為影響微生物群落時間動態的因素。
大多數自然生態系統的特徵是高度的空間結構，這被認為對許多生態系統服務都很重要。 考慮到空間規模，可能意味著要比較遠處區域之間的微生物模式，以及相同生境的生存空間之間的區別不明顯（圖4b）。
植物多樣性與土壤微生物組多樣性的相互影響
土壤主要由微團聚體（<0.25毫米）組成，這些團聚體結合土壤有機碳並保護其免受侵蝕，而大團聚體（0.25到2毫米）則限制了氧氣的擴散並調節了水的流量。 每個聚集體都具有獨特的生態位，並具有其獨特的微生物組結構。 實際上，由於在小空間尺度上存在如此眾多的生態位，土壤被認為是地球上微生物群落組成最多樣化的生態系統。 例如，農業耕作引起的生態位的減少會導致微生物多樣性的喪失。 由於植物和耕作在很大程度上影響土壤結構的發展，植物多樣性的喪失也對土壤微生物組的生物多樣性產生了強烈影響。
但是，對於「先生雞還是蛋」的答案尚不清楚（土壤微生物組的變化會引起植物多樣性的改變，反之亦然）。微生物群落對宿主的定殖也不均勻。
眾所周知，例如，葉子的根部與根部相比具有不同的菌群，並且根部本身被微生物異質地定殖，沿著根際的長度以及根部表面與根部內部的微生物群不同。
最近，種子微生物群作為核心微生物群從一代到另一代的垂直傳播的一種可能模式引起了人們的關注。
與植物相似，人體也不是被微生物均勻地定殖的：每個人體隔室都包含自己的微生物群，甚至來自一個身體部位的微生物群也可能因採樣面積而異（例如皮膚微生物群）。
微生物熱點和熱點時刻通常緊密相連。例如，土壤的特徵是存在所謂的微生物熱點（包括根際，小球層或碎屑層在內的空間分離）和熱時刻（時間動態）。在熱點中，活躍代謝微生物的比例是非熱點中微生物的2-20倍，與微生物活性較低的部位相比，熱點中微生物組結構和功能的時間變化更具動態性。
06
核心微生物群定義
基於共現分析和捕獲微生物群落時空動態的實驗數據，研究人員尋求定義核心微生物群落。這確實是有幫助的，因為本地微生物群通常非常複雜，包括來自不同王國的數千種物種。
定義核心微生物群可以幫助區分微生物群的穩定成員和永久成員，這些種群可能是斷斷續續的，僅與特定微生物組狀態相關或僅限於特定環境條件的種群。
Shade和Handelsman提出了第一個建議，他們將核心微生物組定義為來自相似棲息地的微生物群落之間共享的一組成員，以鑑定複雜微生物群中穩定，一致的成分。
當前，核心微生物群主要是根據具有分類學信息的DNA序列來定義的。考慮到基於DNA的分析（主要是標記基因的擴增子測序）的解析度極限，但是很明顯，核心微生物群主要是通過群體的屬級鑑別來定義的，並且菌株特異性和功能變異是不考慮的。
功能性核心微生物群包含攜帶複製子的媒介
相比之下，Lemanceau及其同事提出了一個功能性核心微生物群，該微生物群包含攜帶複製子（基因）的微生物媒介，而複製子具有對整體生命的基本功能。
最近，Toju等人提出了核心微生物群的概念，專門用於將農業生態系統管理為物種豐富的社區； 他們將核心定義為「形成相互作用核心的微生物集，可用於在各個植物和生態系統級別優化微生物功能。」
「核心」微生物群似乎保持相當恆定
Astudillo-García及其同事在審視高度多樣化的海洋海綿微生物系統時，評估了不同核心微生物群定義的影響。雖然在定義核心社區時必須謹慎，但是，總體結果似乎對核心定義的變化相對不敏感。瞬時微生物群隨時間變化，這取決於環境條件，營養的可獲得性和/或宿主的生長和健康階段，甚至晝夜節律。相反，「核心」微生物群似乎保持相當恆定。就時間動態而言，核心微生物群描述了與給定宿主基因型或特定環境持續相關的微生物群落（圖4a）。
這一概念的例外情況也被描述過，例如，在最佳適應再次發生水合/脫水循環的微生物組中，不同的細菌群落在循環中發揮了不同的功能：兩者均屬於核心。類似地，在空間尺度上，例如，考慮在同一地理區域或同一地理區域的一系列土壤中生長的植物，核心微生物群不變（圖4b）。
07
從功能預測到表型
研究微生物組的當前可用方法，即所謂的多組學方法，範圍從高通量分離（培養組學）和可視化（顯微鏡）到靶向分類學組成（宏條形碼）或解決代謝潛能（功能基因的宏條形碼，宏基因組學） 分析微生物活性（代謝組學，代謝組學，代謝組學）（下圖）。
圖5 評估微生物功能的方法
基於宏基因組數據，可以重建微生物基因組。 雖然從環境樣品中重建了第一個由基因組組裝的基因組，但近年來，數千個細菌基因組在沒有培養其背後的生物體的情況下被組合在一起。 例如，最近從9,428個宏基因組中重建了全球154,723個微生物基因組。
然而，由於一方面微生物基因組DNA序列數據的大量可利用性與另一方面確認基因功能的宏基因組學預測所需的微生物分離物的可利用性之間缺少聯繫，理解仍然受到很大限制。
宏基因組數據為新的預測提供了場所，但是需要更多的數據來加強序列與嚴格的功能預測之間的聯繫。 考慮到一個胺基酸殘基被另一個殘基取代可能導致自由基功能改變，從而導致給定基因序列的功能分配不正確，這一點變得顯而易見。
此外，需要培養新菌株以幫助鑑定從宏基因組學分析中獲得的大部分未知序列，對於研究不足的生態系統，這些序列可能超過70％。根據應用方法的不同，即使在經過充分研究的微生物組中，完全測序的微生物基因組中有40-70%的注釋基因沒有已知或可預測的功能。
另外，目前的估計預測，具有未知功能的域將很快超過已知功能的族。顯然需要更經典的微生物學，包括結合使用靶向突變體和微生物生物化學來應對這一挑戰。
從已經發現的具有未知功能的蛋白家族的全面功能表徵中獲得的好處，遠不止於進一步擴展這些家族的列表。儘管長期以來，結合（廣泛的）培養和獨立於培養的分析相結合的多階段方法一直是環境和植物微生物學領域的最新技術，但醫學微生物學通常並非如此。 近年來，高通量培養組學建立了人類腸道菌群的參考基因組和培養集。
了解原核生物的功能多樣性非常具有挑戰性
因為目前建立的118種門中有85種迄今尚未描述過單一種。最後，原核門的數量可能達到數百個，而古細菌門的研究最少。這個問題需要通過收集尚未培養的原核生物有意義的分類學和功能信息來解決。純培養中細菌和古細菌的多樣性與通過分子方法檢測到的細菌和古細菌的多樣性之間的差距日益擴大，這導致人們提議主要根據序列信息為尚未培養的分類單元建立正式的命名法。
原核生物國際命名法的建議修改
根據這項建議，念珠菌屬的概念將擴展到密切相關的基因組序列的組，並按照已建立的細菌命名規則公布其名稱。對原核生物國際命名法的建議修改引起了以下方面的關注：
（1）命名法的可靠性和穩定性；
（2）技術和概念上的局限性以及參考基因組的可用性；
（3）計算機功能的信息內容預測；
（4）識別微生物多樣性的進化單位。
這些挑戰需要克服，以達到一個有意義的分類學尚未培養的原核生物，目前尚不清楚的表型。 在這種背景下，已經做出了巨大的努力來培養來自不同環境的細菌。
Staley和Konopka在1985年確定了「大平板計數異常」，它描述了一個事實，即90至99.9％的細菌物種無法在標準實驗室條件下生長。對於某些微生物棲息地，尤其是那些具有較高養分含量和微生物活性的微生物，如腸道微生物群所述，相對於通過測序檢測到的分子種類，培養物中可利用的代表性菌株的比例從35％增長至65％。
來自其他自然棲息地的微生物種群以及微生物組的真核成員也需要類似的進展。微型真核生物，如原生動物、真菌和藻類的成員，通常可以更好地培養和顯微鏡下研究；然而，它們的系統發育和分類學更複雜，研究較少。有趣的是，來自不同環境的16S和18srRNA基因的無引物測序表明，在微真核生物中，有大量以前未檢測到的類群。
同位素探測技術
除了當前使用的計算機模擬比較和培養方法外，還可以使用一組同位素探測技術直接測試複雜微生物群落中的功能假設。這些方法包括DNA，RNA，蛋白質和脂質穩定的同位素探測（SIP）以及FISH顯微放射自顯影，FISH-NanoSIMS和FISH-Raman顯微光譜學，後三種方法僅提供一種細胞解析度。
RACS平臺無需培養即可研究微生物代謝途徑
最近，開發了一種微流體拉曼活化細胞分選（RACS）平臺。在最近的一項研究中，Lee和他的同事在存在氘水的情況下，允許小鼠結腸菌群中的細胞代謝未標記的目標化合物（粘蛋白）。隨後，使用RACS平臺從複雜的微生物組中選出了活躍地代謝粘蛋白的氘標記細胞，並通過單細胞基因組學和培養方法進行了進一步分析。
這種方法允許以一種新型的無栽培方式將微生物的代謝表型與其基因型聯繫起來，從而使從微生物的潛能到微生物的功能成為可能（圖5）。
儘管取得了一些進展，但這種功能分類平臺的產量仍然有限，而FISH和生物正交非標準胺基酸標記（BONCAT）等互補的新技術解決方案將有助於微生物組研究中更迫切需要的以表型為中心的研究。
08
宿主微生物共進化
宿主及其相關微生物之間的密切關係引起了宿主及其相關微生物群共同進化的理論。協同進化是沿襲相互適應的譜系。
一個例子是建立早期的陸地植物，這是由共生真菌聯合體促進的，這表明植物自從首次出現在土地上以來就已經與微生物共同進化了。
另一個例子是真核生物。 線粒體和質體是真核細胞中的細胞器，來源於內共生細菌，在整個進化過程中，它們完全取決於宿主，反之亦然。 為了促進對微生物群的全面了解，需要考慮宿主微生物的協同進化（下圖）。
圖6 對微生物-宿主協同進化的理解從「分離」理論轉向整體方法
基於微生物與其宿主之間的相互作用，將微生物分為有益的，致病的和中性的，是廣泛引用的Lederberg和McCray關於微生物組定義的一部分。
根據他們的解釋，拮抗協同進化包括宿主-寄生蟲的相互作用，而當積極相互作用佔優勢時，則存在互助協同進化。這種積極的相互作用可能演變成專性共生，垂直遺傳和代謝協作（上圖）。
根據致病微生物，有益微生物和中性微生物與宿主之間的相互作用，對致病微生物，有益微生物和中性微生物進行分類可能對微生物宿主相互作用在調節宿主適應性中起核心作用的研究（例如醫學研究）有用。 然而，對致病性數據的解釋應謹慎。
對條件致病菌的最新研究表明，宿主與微生物的相互作用不僅取決於宿主，還取決於整個微生物組。自然抑制疾病的土壤表明植物和許多土壤傳播條件致病菌的情況類似。
此外，在許多環境研究中，可能沒有長時間可利用的特定宿主，這使得劃分致病菌和有益菌變得無關緊要。
與其研究一種特定微生物與其宿主之間的相互作用，不如考慮基於全環素理論的整體方法（圖6）。 按照這種方法，宿主及其微生物組之間的有益相互作用負責維持整體生物的健康，而疾病通常與微生物失調有關。
在失調的背景下，建立了「病原體組」概念（圖6），該概念代表了整合在其生物環境中的病原體，並應用於多種病理系統。這種方法表明，微生物多樣性是預防植物和人類腸道疾病的關鍵因素。
儘管進行了眾多研究，定義了「健康的微生物群」，但是在未來，平衡和失調之間的界限仍然是一個重大挑戰。
微生物與宿主之間相互作用的另一種有趣解釋是所謂的「安娜·卡列尼娜原理」 。聲明指出，與列夫·託爾斯泰的格言類似，「所有幸福的家庭看起來都一樣； 每個不幸的家庭都會以自己的方式感到不幸。」
與健康的個體相比，菌群失調個體的微生物群落組成差異更大
例如，健康珊瑚的微生物群比患病珊瑚的微生物群更均勻。 同樣，最近的一項研究發現，炎症性腸病患者的群落組成和免疫反應的穩定性明顯低於健康人。
進化過程和選擇壓力極大地推動了宿主-微生物的相互作用
因此，區分為人造的，以人為中心的類別可以隨時間變化。一個例子是幽門螺桿菌，它是二十世紀初期幾乎所有人胃中的優勢微生物，在短短100年內幾乎消失了。 幽門螺桿菌一方面是消化性潰瘍和胃癌的危險因素；另一方面，這種細菌的丟失與兒童時期的哮喘，花粉症或皮膚過敏有關。
微生物與其預期宿主之間複雜的進化相互作用的另一個例子是病原體的出現，如嗜麥芽單胞菌，這種植物相關起源的細菌與全球人類條件致病菌株沒有區別。 總而言之，自然選擇被認為有利於塑造群落組成的宿主，從而促進有益的宿主微生物共生，但是許多因素可以使這種動態失衡，從而誘導宿主微生物組內對病原性或拮抗性微生物的選擇。
基於計算模型，Lewin-Epstein等人提出，操縱宿主以利他行為行動的微生物可能會受到選擇的青睞，並可能在利他主義的廣泛發生中發揮作用。
宿主微生物共同進化導致與植物和動物相關的特定微生物群。這種特異性的程度受許多因素影響，並且在系統發生分支之間也有所不同。 對於代表地球上最古老的陸地植物的苔蘚而言，其植物特異性異常高。 這種特異性與宿主的地理來源無關，並且從子孢子垂直傳遞至配子體，反之亦然。
馴化和育種活動也可以顯著影響宿主微生物組
在某些情況下，其程度也超出預期。消失的微生物群系的理論表明，流行的慢性病是由人為微生物群向多樣性降低的轉變所引起的。考慮到這一點，重要的是重新考慮我們的行為（例如，對家庭環境進行「過度清潔」）並評估作物管理方法（例如育種策略），以避免喪失共同進化的有益宿主微生物相互作用。
09
微生物組研究技術標準
在過去的十年裡，面對微生物學領域顯著而持續的技術進步，研究界未能為微生物組研究制定一致的標準。這導致了許多缺點，包括缺少實驗室間數據交叉比較的可能性，或者在最近的研究中使用「舊」技術生成的數據的實現。
有大量出版物表明DNA提取和加工程序對微生物組的後續分析存在偏差。使用定義的模擬群落一方面可以幫助確定最佳的提取方法，另一方面可以作為內部控制來估計整個工作流程和分析中的可能偏差。
但是，即使將模擬群落實施到分析中也不能解決所有問題，這會給從環境樣本中進行微生物群落的分子分析帶來偏差。 例如，不能通過將模擬群落應用於土壤來反映土壤微生物對土壤顆粒的自然吸附過程。
此外，在複雜的棲息地（例如土壤）中，多達80％的提取DNA可能包含遺物DNA（死細胞的細胞外DNA以及活細胞的分泌DNA）。這種殘留的DNA可能會增加觀察到的原核和真菌的多樣性，並導致對分類單元相對豐度的估計不準確。
PMA法有效地抑制了革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌死亡細胞中DNA的PCR擴增
Nocker等人提出了一種可能的解決方案使用疊氮溴化丙錠(PMA)的方法，該單疊氮化物僅穿透膜受損的細胞，其中光誘導的疊氮化物基團與DNA共價結合； 這種交聯有效地抑制了革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌死亡細胞中DNA的PCR擴增。該方法已成功應用於微生物組研究，尤其是微生物豐度低和活性低的研究，但這還不是標準。
DNA處理中的一個眾所周知的例子是通過分析引物組和引物選擇和PCR誘導的選擇性擴增或大量未知讀物。Karst等人開發的無引物rRNA基因測序方法促進了未知微生物多樣性的發現。
作者建議將SSU rRNA分子的poly（A）尾和逆轉錄與合成的長讀測序結合起來。使用這種方法，他們能夠以高通量產生高質量，全長的SSU rRNA序列，而沒有引物偏倚，並且在他們的研究中觀察到了迄今未描述的多樣性中的很大一部分。
對獲得的序列數據進行生物信息學分析既不是標準化的，也不是明確表達的偏見。為了進行16S rRNA基因序列的數據評估，可以使用免費軟體解決方案和完善的論壇，例如Qiime2和Mothur。
操作分類單元（OTU）長時間用於分析高通量條形碼，例如使用標記基因（如16S rRNA和/或ITS區域）獲得高通量測序數據。
另外，可以使用基於精確解析的擴增子序列變體（ASV），低至測序基因區域上的單核苷酸差異水平。立即獲得更好的解析度的好處顯而易見，ASV作為具有固有生物學意義的一致標籤的狀態獨立於參考資料庫而被確定。可重用性，可再現性和全面性方面的改進足夠大，以至於ASV可以取代OTU作為標記物基因分析和報告的標準單元。
為了比較不同的工具和管道，已經進行了一些研究和聯合項目，結果表明，根據工具或管道以及所使用的設置，結果存在顯著差異。顯然，除了足夠的測序深度之外，用於注釋讀段的資料庫的選擇對結果有很大影響。
此外，通常會自動完成的參數選擇（例如截止值，嵌合體過濾等）對結果有很大影響。例如，由於數據評估方法僅允許調查代表性超過1％的分類單元，因此經常忽略稀有分類單元。
然而，這種罕見的分類單元最多佔所有微生物的28％，可以代表某些生境中的關鍵角色，並且可能對構建社區具有重要意義。它們在生物地球化學循環中可能起著過比例的作用，並且可能是微生物組功能的隱性驅動因素。而且，攜帶抗生素抗性基因的微生物通常屬於天然微生物群中的稀有分類群。 在壓力條件下，它們為健康和生存提供了保障，並確保了生態系統的可塑性。
但是，在動物和人類腸道微生物組中，這些方面對於疾病暴發和治療至關重要，因此在WHO對抗生素耐藥性擴散的預測中得到了應用。
同樣，在這裡，計算資源仍然是使生物信息學成為微生物組分析瓶頸的問題。Ten Hoopen和他的同事描述說，例如，塔拉海洋微生物群項目的一個子集，已經對原核生物進行了尺寸劃分，包括135個樣本。對於這些樣本的分析，需要248次運行，其中包含288億次讀取，分析輸出代表大約10 TB的數據。這項廣泛的研究產生了232億個預測的蛋白質編碼序列。為了處理如此大的數據，在過去的10年裡出現了幾個全球微生物組學項目，如人類微生物組群項目和地球微生物組群項目。
此外，宏數據方面的巨大差距，通過阻礙研究的可比性和綜合分析，限制了微生物組分析。確實有一些數據存儲庫，例如序列讀取檔案SRA（NCBI）、歐洲核苷酸檔案（ENA）或CNGB核苷酸序列檔案（CNSA）。然而，在許多情況下，數據只「按要求提供」，這與可查找、可訪問、可互操作和可重用（公平）原則相矛盾。即使數據是可用的，宏數據往往缺乏重要的信息，並且沒有得到包括實驗和統計研究設計信息在內的知識庫的充分審查。
Schloss和他的同事發表了一篇綜合性的綜述，關於識別和克服微生物組學研究中再現性、可複製性、穩健性和普遍性的威脅。因此，迫切需要標準化和開發正確和全面的宏數據存儲庫平臺，如Proctor所示，他開發了人類病原體/載體基因組序列的項目和樣本應用標準。Ten Hoopen和他的同事描述了一個設計良好的策略，允許制定和應用標準，並根據公平原則從微生物組研究中獲得可比較和可重用的數據。
10
微生物研究的未來展望與挑戰
在經濟學技術進步的推動下，微生物組數據的不斷增加，使得我們對微生物組群在提高不同系統的生產力和可持續性方面的潛力的理解有了極大的提高。應用微生物研究的宏偉願景是改善人類、動物、植物和整個生態系統的健康。
一般來說，微生物組可以通過以下方式直接管理：（i）微生物組移植
（ii）具有有益特性的微生物
（iii）微生物群活性代謝物，或通過改變環境條件，使微生物群也將其結構和功能從失調狀態轉變為健康狀態。
在比較人類、動物和種植系統中基於微生物的應用時，可以看到顯著的協同作用（下圖）。
雖然各個領域還沒有很好地聯繫起來，但所有領域的一致趨勢已變得明顯。這一趨勢涉及到對定製治療的關注，例如，「下一代」精確農業或個性化藥物（下圖）。這一概念認識到，並不是所有的個體宿主及其相關的本土微生物群都會以相同的方式對特定的引入微生物、微生物群落移植或代謝物作出反應。
圖7 跨領域的微生物組應用趨勢
相反，它依賴於對那些特定宿主微生物、環境微生物和微生物相互作用的基本理解，這些微生物在不同的環境中調節微生物組合和功能能力。
Stegen等人在其微生物組管理的概念框架中，建議在不同領域進行更大的串擾，例如，利用環境微生物組學中的特定生態概念來指導優化策略，以操縱人類微生物群，從而改善健康狀況。
通過為各種環境和代謝疾病提供有趣的解決方案，人類微生物群正逐漸成為個性化醫學的一個關鍵目標。不僅有助於疾病各個方面的個體差異，也代表了潛在的治療目標，可通過治療，飲食變化，使用前，益生元或合生元，與之相對應的生命生物治療產品來調節物種或物種混合（合成微生物群）和微生物組移植。
植物生物群落路線圖
以此類推，植物微生物組被認為是下一次綠色革命（到2030年的科學突破）的關鍵。結合植物育種，精準農業，農業管理和微生物組研究的系統方法，為在不斷變化的世界中改善可持續作物生產提供了強有力的戰略。
跨學科團隊將這種方法包含在特定環境中可能影響植物生產的許多生物和地球物理成分，稱為「植物生物群落路線圖」 。
特定於物種和棲息地的植物微生物區系對植物整體生物的功能有多個方面，例如（i）種子發芽和生長，（ii）營養供應，（iii）對生物和非生物脅迫因素的抵抗力，以及（iv）產生生物活性代謝物。 由於其對作物健康的重要性，對植物微生物組進行了長期的研究。
此外，在農業領域開發了廣泛的微生物組管理策略和產品清單，包括（i）微生物組移植（糞便和生物動力添加劑），（ii）微生物接種劑，（iii）微生物和植物提取物以及（iv）改變環境條件的方法。
在過去的幾十年中，管理密集型農業主要依靠合成化學物質，導致嚴重的環境和健康問題以及生物多樣性喪失。另一方面，對植物微生物組學的研究將支持針對田間特定條件的針對性和預測性管理方法，從而可以提高可持續性。
種子/根際微生物組對植物至關重要，與我們的食物微生物群緊密相連
與人類腸道微生物組相似，種子/根際微生物組對植物至關重要，種子是下一代微生物的理想靶標。 Pérez-Jaramillo及其同事提出了種子的「回歸根源」方法，這為揭示野生親緣種和古代傳家寶品種的種子微生物群提供了一個有趣的機會，以節省有益的種子微生物群用於農業。
利用農作物野生近緣種的種子微生物群或利用有前途的生物資源，有可能實現植物與其特定種子微生物群之間的匹配共生。 收穫後微生物群與我們的食物微生物群緊密相連，也可以針對食品的所需功能特性進行管理，例如安全性和保存性，感官或健康特性。
這代表了一個相對尚未開發的基於微生物組的應用，它正在受益於食品生態系統中新出現的大量數據。
生活方式-微生物-人類-健康的聯繫
微生物群的重要性超出了個體宿主的健康。來自不同宿主和生態系統的微生物可以相互作用並相互影響。這些觀察結果導致了「健康環境促進健康人類」的口號，支持「One Health」概念。
【註：「One Health」意指多學科共同合作,為人類健康,動物健康,環境健康三者共同成為一個健康整體而進行的工作和努力.「One Health」是一個新的名詞,但是這一概念是很早之前已經存在的.2003年4月7日,華盛頓郵報的Rick Weiss引證了獸醫博士William Karesh的話「人類和家禽或者野生動物的健康再也不能分開談論了,世界上只有『One Health』,所有的問題解決辦法需要各個學科的工作人員共同努力,在不同的層面為問題的解決作出貢獻.」關於「One Health」,目前國內翻譯的名稱非常不一致,比如「唯一健康」,「共同健康」,「一體化健康」, 「大健康"等，編者在此不做翻譯。
引自：Xiao Zheng, 陸家海, Sarah K.White,等. 應用"One Health"策略解決複雜健康問題[J]. 中華預防醫學雜誌, 2014, 000(012):1025-1029.】
根據世界衛生組織的說法，「One Health」是一種設計和實施方案、政策、立法的方法，以及多個部門進行交流和合作以取得更好的公共衛生成果的研究。「One Health」概念的擴展，包括環境健康及其與人類文化和習慣的關係表明，在社會決策和政策制定過程中，應考慮生活方式-微生物-人類-健康的聯繫（圖7）。例如，城市化與過敏、哮喘和其他慢性病的增加有關。此外，在城市地區觀察到總體汙染模式，即微生物多樣性的顯著喪失，這與疾病的發展有關。
Dominguez Bello等人表明，伴隨工業化而發生的人類微生物群的變化可能是代謝、免疫和認知疾病急劇增加的潛在因素，這些疾病包括肥胖、糖尿病、哮喘、過敏、炎症性腸病和自閉症。多樣性的喪失反過來又與細菌對抗生素的耐藥性增加相關，因此，需要實施策略來恢復建築環境中的細菌多樣性。了解不同宿主和棲息地的微生物群之間的複雜聯繫及其與人類、動物和植物健康的關係，為在One Health概念的背景下進行診斷、治療和幹預提供了創新和整體方法的潛力。
類似One Health，存在著將人類與環境健康聯繫起來的不同概念；行星健康概念是最流行的概念。許多國家和國際生物經濟戰略也承認這一主題，在這些戰略中，可持續的生物產品生產滿足了經濟的需求。毫無疑問，要使這些概念成為成功的故事，不僅需要自然科學不同學科之間的相互關聯戰略，而且需要社會科學和利益相關者的整合。
然而，我們現在所面臨的往往是相反的：生物多樣性喪失、汙染、臭氧消耗、氣候變化、生物地球化學循環邊界的跨越，都是人類世這個時代的特徵。上新世也反映在行星邊界概念中。
人類活動已經跨越了九個行星邊界中的四個：氣候變化、生物圈完整性的喪失、陸地系統的變化和生物地球化學循環的改變。
首先，研究表明，它們改變了整個微生物群落的功能和遺傳多樣性；然而，關於這些人為因素對不同微生物群落的影響及其對我們地球的影響的更多知識是絕對必要的。在這裡，研究人員認識到迫切需要更多的研究，特別是關於環境微生物組和人為驅動變化的機制性見解。
了解海洋和陸生微生物群落及其相互作用可能是找到解決與上流新世相關的巨大挑戰的關鍵。微生物群管理和基於微生物群的高潛力創新的開發在各個應用領域都是有希望的，但同時也應仔細評估這些新的和有前途的技術對環境的影響。
11
結 語
基於該領域的最新進展，研究人員建議恢復Whipps等人提出的微生物組術語的原始定義。該定義包含了1988年發表後30年內仍然有效的所有要點，並通過兩個解釋性句子對微生物群和微生物組進行了區分，並宣布了其動態特徵。
微生物組
微生物組被定義為一個具有獨特理化性質的、佔據合理、明確的棲息地的微生物群落。
微生物組不僅指所涉及的微生物，還包括其活動區，從而形成特定的生態位。
微生物組是一個動態的、互動的微生態系統，在時間和規模上都會發生變化，它整合在包括真核生物宿主在內的宏觀生態系統中，對它們的功能和健康至關重要。
微生物群
微生物群由屬於不同領域的微生物組成（原核生物[細菌、古生菌]、真核生物[例如原生動物、真菌和藻類]），而「它們的活動區」包括微生物結構、代謝物、可移動遺傳元素（例如轉座子、噬菌體和病毒）以及嵌入到棲息地的環境條件。
此外，作者認為以下幾點對於微生物組研究至關重要：
1.核心微生物群是一組來自相似棲息地的微生物群落之間共享的成員，這對於了解穩定性，可塑性以及在複雜微生物組合中的功能非常重要。
2.從宏觀生態學改編的理論可能有助於理解不同環境中微生物組動力學的模式，但需要驗證其一般應用。
3.每個微生物組研究的基礎都是適當的實驗，方法和統計設計。 在設計中應通過以下方式實現空間，時間和發育的整合：（i）根據系統特性選擇適當的採樣頻率，以捕獲完整的核心和瞬時微生物區系；（ii）通過考慮系統的適當空間規模 認識到規模的子集也與微生物群評估有關，並且（iii）對於強動力系統，應考慮研究微生物分布的時空連續體，而不是捕獲一個特定的矩/空間單位。
4.方法學的進步極大地推動了微生物組的研究。 儘管在這方面取得了所有進展，但是還沒有完美的通用方法。技術工具箱將減少每種技術帶來的偏差，並從整體上更完整地了解生物系統。
5.微生物功能在生態系統中起著重要作用。 因此，我們建議在微生物組研究中包括幾種當前可用方法的組合，以便對微生物功能有更深入的了解。
6. 儘管在過去十年裡，我們獲得了大量的組學數據，但我們仍然缺乏關於其背後的生物信息。因此，在微生物組學研究中實施更多基於培養的方法需要大力的努力，這樣可以描述特定微生物群的生態類型和適應環境的模式。
7.微生物相互作用是微生物群落功能和進化動力學的基礎。 因此，我們提倡考慮研究設計中的相互作用。
8.宿主與微生物的相互作用決定了相互適應性，表型和新陳代謝，從而提出了微生物群及其宿主的協同進化理論。 我們建議基於進化的全基因組理論的整體方法。 整體人的疾病狀態以生物失調（病原體組）為特徵，而尤物病是指平衡的宿主－微生物相互作用（「健康」微生物組）。
9.根據微生物與宿主之間的相互作用，將微生物分為有益的，致病的和中性的是基於人類中心觀。確實，宿主和整個微生物組的生理學在很大程度上影響相互作用的結果。
這些澄清和建議的應用將有助於研究人員以整體的方式設計其微生物組學研究，這將有助於開發微生物模型和預測，進而加快我們在生活各個領域設計應用程式的能力。
【參考文獻】
Berg et al. Microbiome (2020) 8:103
https://doi.org/10.1186/s40168-020-00875-0
人類微生物組正逐漸成為個性化醫學的一個關鍵目標
植物微生物組是下一次綠色革命的關鍵
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