重溫!藥明康德TLC薄層(點板)技術

2021-01-20 製藥人資源

慢慢開始理解書讀百遍的重要性！

TLC薄層技術原理：利用吸附劑（矽膠）對樣品中各組分吸附能力不同，即展開劑對它們的解吸附能力的不同，使各組分達到分離的目的。


TLC薄層技術特點：微量、快速、簡單


1、幾種矽膠板標註方法


                           

遵守原則：點樣的高度一定要高於展開缸中展開劑的高度

原點間距0.3-0.5cm，底邊距離0.5-0.8cm即可


2、幾種反應類型

是不是所有的反應液都可以使用TLC檢測呢？否否否，那什麼樣的體系可以使用TLC檢測呢？


2.1 一般機型溶劑體系（CH2Cl2,THF,ethyl acetate,etc）


可以直接取樣，也可以稀釋後取樣(如果反應體系濃度太大，需要適當稀釋後再TLC檢測)。

2.2 強極性溶劑體系（如DMSO, DMF），不適宜直接取樣進行TLC檢測，最好簡單後處理（加水和有機溶劑萃取）以後取樣  （製藥人資源小弟弟親身經歷，真的真的不適宜直接取樣點板子）


因為DMF,DMSO的沸點很高，不易吹乾，再加上它們的極性比較大，如果直接取樣進行TLC檢測的話，就會導致整個展開劑的極性增大，會使展開效果大打折扣，特別是對於一些本身極性比較接近的化合物，更不利於極性大小的判斷，所以碰到這種反應類型，通常處理辦法是取一些樣品放於離心管內，再往離心管中加水和乙酸乙酯，震蕩幾下後放置，取乙酸乙酯相進行TLC檢測，這樣通過簡單的萃取過程可以把樣品萃取到有機相中，而DMF或DMSO會被留在水相內。


2.3 需要猝滅的體系（NaH, LiAlH4,n-BuLi, etc），需處理（如加水或酸和有機溶劑）後取樣


NaH, LiAlH4, n-BuLi, etc反應完後會以鹽的形式存在，沒辦法直接取樣進行檢測，需要簡單後處理後，再進行檢測。具體的操作是取些樣品放於離心管內，加水或酸淬滅後，再加入有機溶劑，震蕩後再進行TLC檢測


2.4 強鹼、酸性物質（NaOH, H2SO4, etc），最好中和後取樣


Eg. 含吡啶結構的化合物，在強酸性體系內會成鹽，顯然直接取樣進行TLC檢測是不合適的，這是就需要中和後，在進行檢測，判斷。

需要注意：1.產品在水相還是有機相；2.有沒溶解固體


3、特殊情況處理


3.1. 後處理有機層產物很少


看看是否產物極性太大，水溶性太好，有機層水層同時點板

取樣進行TLC檢測時，確實對反應進行簡單的後處理，但發現萃取後有機相沒有要的東西，或東西很少，碰到這種情況，回頭再檢測水相，看東西是否在水相中，沒被萃取到有機相中，因為碰到一些極性較大的化合物時，它們在水相中的溶解度很好，就不會很容易萃取帶有機相了，所以我們在TLC檢測時，最好是有機相和水相點在同一塊板上，同時檢測來綜合比較。


3.2. 反應體系中有不溶物怎麼辦？


把沒有溶解的固體取出後找合適的溶劑溶解後再跟溶解的部分共同TLC檢測比較來綜合判斷反應進行的情況


在用TLC 跟蹤反應時，發現反應體系裡有不溶解的固體，這種情況，很多時候可能會把它忽略掉，直接只取溶解的反應液直接跟蹤，這種操作方法是不正確的，有時候固體就是產物，如果只取反應液檢測，就會得出與實際情況不符的結論，導致我們判斷失誤。還有一些反應是原料在反應體系中溶解度不好，但是產物溶解度比較好，TLC跟蹤時如果只點反應液的話，可能會認為原料已經反應完了，就草草的把反應處理掉，但實際上原料還剩下很多，所以建議大家碰到這種情況時，取出一些固體，找其他合適的溶劑溶解後，再和反應液一起來進行TLC檢測，綜合判斷反應進行的情況


3.3. Boc等保護氨基脫Boc保護成鹽情況，如何分析


這種反應一般是在鹽酸甲醇，鹽酸乙酸乙酯等酸性體系中進行，那麼反應完成後，生成的胺在這種酸性體系中無法以游離的形式存在，而是以鹽酸鹽的形式存在，所以在TLC跟蹤反應時，如果發現原料已經反應完全，而在原點有一個很大的斑點的話，通常是可以得出反應已經進行完全的結論了


3.4. 從羧酸做醯氯的反應，醯氯等活性物質如何檢測


醯氯的活性很高，直接取樣進行TLC檢測的話，可能會碰到空氣中的水汽又會使其變回羧酸所以直接進行TLC檢測並不可行，我們可以利用它活性高的特點，可以去一些反應液出來溶解到甲醇或甲胺類物質中，這樣反應液就會與甲醇或甲胺類物質反應酯或醯胺，然後借用TLC或LCMS等檢測手段，通過檢測生成的酯或醯胺來判斷反應進行情況 


4、點樣

 

Note: 

a. 點樣的濃度要控制適當。如果點樣太濃的話，特別是對於極性相差不大的化合物，就會導致它們的分離度變差，出現兩個點重合成一個點的現象，同樣點樣濃度太稀，也不利於檢測判斷。

b. 點的斑點越小，展開的TLC分離度越好。

c. 0.3mm毛細點有機相，0.5mm點水相較方便。


5、TLC展開劑


展開劑的選擇原則：


a.對所需組分有良好的溶解性;
b.可使各組分間有較好的分離;
c.待測組分的Rf 在0.2～0.8之間;
d.不與待測組分發生化學反應;
e.沸點適中，黏度較小；

f.展開後組分斑點圓且集中；

g.混合溶劑最好新鮮配製


常用展開劑極性大小順序：

石油醚<二氯甲烷<乙醚<四氫呋喃<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水


展開劑體系的選擇原則:

1.     一般極性的化合物:PE（石油醚）/EA（乙酸乙酯）體系

2.     極性較大的化合物:DCM（二氯甲烷）/CH3OH體系

可以通過調節兩種溶劑的配比來調節展開劑的極性大小，對於一般極性的化合物，通常，用石油醚乙酸乙酯體系就可以，如果化合物的極性很大，用純乙酸乙酯Rf值都很小時，就要選擇二氯甲烷甲醇體系了。


 

展開劑體系的選擇原則：

脂肪類胺化合物:在用矽膠板展開時，由於矽膠的弱酸性作用，比較容易出現拖尾的狀況，那麼以在展開劑中加入0.1%（約為1滴）的氨水或三乙胺混合均勻後再展開，能比較的減少或抑制拖尾情況


有羧基官能團存在的化合物:

在展開劑中加入微量的醋酸（乙酸或甲酸的作用，一方面增大展開劑極性, 另外也可以抑制矽膠上羥基的作用，減少拖尾）另外常用的混合體系:
PE/DCM， PE/Acetone（丙酮），EA/DCM， EA/CH3OH


6、展開方法

展開方向有單向、單向長版、多次、多種極性展開等

最常用的是單次展開，如果展開一次後兩個斑點離的很近，可以選擇換一塊長板，或多次展開，如果反應體系中的物質極性跨度比較大，可以選擇多種極性展開的方式，即可以將TLC板放入石油醚乙酸乙酯體系中，先將極性較小的化合物展開，拿出來吹乾後，再放入大極性的二氯甲烷甲醇體系中，將大極性的物質展開。


 


7、展開結果分析判斷



一般以目標產物的Rf值在0.4-0.6左右為最佳；一般選用展開劑極性應從低到高原則。展開後的點位置偏高或偏低較多，需要重新調整展開劑的配比，或者換展開劑體系


8、顯色

一看：首先在日光下觀察，劃出有色物質的斑點位置。

如一些含硝基的化合物，在日光下就可以看到黃色的斑點

二照：在紫外燈下觀察有無暗斑或螢光斑點

三碘：對於紫外吸收很弱的物質，可以用碘缸進行顯色，利用大部分有機物會吸附碘可逆的產生棕色或黃色斑點，用碘缸進行顯色時，需要注意以下兩點：TLC板在放入碘缸前，需將溶劑揮發乾或者吹乾；某些胺類化合物如三乙胺、DLEA等在碘缸中也會顯色，所以，如果反應體系中用到這些試劑的話，要注意判斷

四顯：既無色又無紫外吸收且在碘缸中不顯色的物質，可以用顯色劑顯色


常用顯色劑配製方法及用途：



 TLC用途：



TLC是有機合成工作者的眼睛！


1、檢測反應進程：

反應有無新點產生；原料有無剩餘，剩餘多少；反應是否乾淨；綜合判斷反應如何處理。


Note：

1. 點樣量，濃度要合適；

2. 監測時間，對於需要過夜的反應，建議在過夜前檢測反應跟過夜後的反應檢測作對比，從而決定下一次反應是否有過夜的必要，那麼對於某些速度很快的反應，可以將檢測反應的間隔時間儘量縮短一些；

3. 留樣作對照，如果小試已經拿到標準點的話，我們可以留一些樣品，作為放大反應的標樣使用；

4.當碰到一些已經摸索了很多條件，反應效果都不太好的情況下時，建議將重要板留存，把不同反應條件下的TLC板綜合比較，可能會得到一些有用的信息。跟蹤監測反應時還有一點需注意，在TLC檢測時，除了點原料點和反應液點外，最好同時點原料和反應液的交叉點，這樣板展開後更利於分析判斷


2、結合官能團轉化與TLC極性大致表現的討論



對於像硝基還原為氨基，或醛還原為醇的反應，我們看到這些反應產物的極性比原料的極性大，那麼在用矽膠板跟蹤反應時，如果發現原料已經消耗完，而在原料點的下方有主要新點生成的話，大致可以得出反應應該是朝預期的方向進行的結論；相反，對於極性減小的反應，如胺類化合物上保護基等反應，如果TLC檢測發現在原料點的上方有主要的新點生成的話，也能得到類似的結論，但是還有一些反應，如烯烴的還原，這種反應的原料和產物的極性很接近，可能單純的憑藉TLC板，不是很好判斷反應的進行情況，那麼這是就需要藉助其他的檢測手段來綜合判斷了


3、TLC和其他分析方法組合判斷：


TLC- - HPLC/LC- - Ms聯用，可以用於對反應進行定性和定量分析，確定反應有目標產物後，可以將TLC-- MS聯用，確定標樣點，


具體操作：在一塊TLC小板上，上一條樣品帶，展開後將不同的色帶分別刮取後，用溶劑溶解，注射器加濾頭過濾掉矽膠後，將溶液用MS檢測，確定標樣點，如果出現兩條色帶，MS值相同，有異構體的情況，還可以將TLC-- NMR聯用來確認結構


4、跟蹤萃取、重結晶等後處理的情況：

萃取是否有效  

在跟蹤萃取的過程中，不能單純根據有機相有沒有顏色或水相有沒有紫外吸收來判斷，因為可能萃取的次數越多，反而是被萃取到有機相的雜質越多，所以建議在萃取2-3次後可以點一塊TLC板，並一定要把TLC板展開後再來判斷是否繼續萃取。同理，重結晶過程也是如此


固體的純度和母液的取捨

也是要把TLC板展開後再下結論



5、摸索和確定柱層析時的洗脫條件的情況：


Note: 

a. Rf值在0.2左右的展開劑比例為過柱子時的洗脫劑的合適值

b. 由於溶解度的原因，有時過柱時組分流出順序未必和TLC上點極性順序一致

 


有時做了小試後，想拿著標樣點或者量少的產品進一步純化時，不一定非要過柱子，也可以選擇製備TLC來進行，通常比較快速，而且分離效果比較好。


6、製備TLC順序：點板--展開--顯色--刮板--洗脫


點板：

Note：

a. 溶劑：極性小，溶解性好；儘量選擇極性小，揮發性好，對樣品溶解性好的溶劑，如二氯甲烷；


b. 上樣量：40-60mg;如果反應不太乾淨，可適當再減少；c. 上樣位置：距離兩端大約1cm,距離底邊大約2cm，原則是點樣的高度一定要高於展開缸中展開劑的高度


展開：

Note: a. 展開之前要將溶劑吹乾；

b. 所用展開劑的極性較展小板時大，如展小板時展開劑的比例石油醚乙酸乙酯是4:1的話，再用製備TLC時可將展開劑的比例擴大到石油醚乙酸乙酯2:1


上樣時如果上的色帶太寬或不齊，通常直接展開的話，展開效果不是太好，不利於去分析判斷，那麼我們可以在槍頭中塞一點棉花，前端用剪刀剪平整後再去上樣，通常色帶就會比較平整


如果出現上述情況，還可用大極性溶劑預展開2-3cm，來儘量抑制產生的不良影響，具體來講，如果要用石油醚乙酸乙酯為4:1的展開劑來展開，我們可以先將TLC板放入石油醚乙酸乙酯為1:1的展開劑中，展開2-3cm後取出來，色帶就會相對比較平整，將溶劑吹乾後再放入石油醚乙酸乙酯為4:1的展開劑繼續展開


顯色：

與小板一樣也是遵循：一看、二照、三碘、四顯

需要用碘或顯色劑顯色的時候，我們將製備的一側進行部分顯色，活用玻璃刀將TLC板分割下小部分，通過部分的顯色情況，來反推整塊板的顯色情況，所以相對的對板的展開效果的要求比較高



疑似色帶的確定：

如何判斷那條色帶才是目標產物呢？



如果有標樣點的話，可以跟標樣點TLC檢測對照；如果沒有標樣點的話可以將TLC—LCMS或NMR組合判斷；有時在大板展開後，可能會出現像第3塊板的情況，兩條色帶距離特別近，不好判別是不是一個東西，造成這種狀況的原因可能是過載或受潮，建議大家將兩條色帶分別刮取後與標點對照來展開判斷是不是一個東西，再確定能不能合併


刮板：是將不同的色帶刮取後放入不同錐形瓶中進行洗脫


Note：刮板後，在沒有得到確定的結論前不能輕易丟掉薄板


洗脫：儘量選擇溶解度好，極性小的溶劑，通常可用二氯甲烷或者乙酸乙酯，如果化合物的極性很大用純的二氯甲烷或乙酸乙酯洗脫效果不好時，也可選用二氯甲烷比甲醇等於8:1或乙酸乙酯比甲醇等於10：1的混合溶劑進行洗脫，洗脫劑應避免加入過多的甲醇，以免產物中混有大量矽膠，另外，如果需要MS檢測，溶解的矽膠析出後會造成柱子的堵塞


合成民工表示全文都經歷過，哈哈，悽慘，不說了，要處理反應了！


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