【科研成果】
細胞外基質（ECM）在組織再生和疾病進展過程中經歷動態重塑和進行性硬化。但是，大多數人工ECM和體外疾病模型在機械上都是靜態的。11月，四川大學魏強研究員團隊開發了一種模仿自然ECM動態特性的自增強聚合物塗層用於研究細胞對動態生物物理線索的反應並促進細胞機械敏感性反應。螺吡喃（SP）被用作動態錨定基團以調節細胞粘附肽配體的強度。得益於自發性的花菁向螺吡喃的熱異構化（MC-SP），所得的自響應塗層顯示出界面相互作用的動態自增強。與靜態和所有先前的動態人工ECM相比，此自響應表面上的細胞重塑了弱結合的基於MC的塗層，從而在黏附早期激活了α5β1整聯蛋白和Rac信號傳導。隨後的MC到SP的轉化增強了配體與整合素的相互作用，從而在後期進一步激活了αvβ3整合素和RhoA / ROCK信號傳導。此順序過程增強了細胞機械轉導以及間充質幹細胞（MSC）的成骨分化。值得強調的是，自增強在沒有任何刺激的情況下會自發發生，這使其特別適用於再生醫學中植入的支架。相關論文SelfStrengthening Adhesive Force Promotes Cell Mechanotransduction發表在《Advanced Materials》上。
【圖文解析】
作者開發了一種自反應性單層聚合物塗層，該塗層在沒有任何額外刺激來促進細胞機械轉導的情況下，表現出界面相互作用的可編程自增強作用。該塗層的動態特性是通過自發的熱花菁-螺吡喃（MC-SP）異構化而實現的，而花菁（MC）和/或螺吡喃（SP）被用作通過疏水相互作用將其拴繫到細胞粘附配體上的錨定基團（示意圖1）。螺吡喃是一種眾所周知的光致變色分子，可以在紫外線（UV）照射下從更疏水的SP形式迅速異構化為更親水的MC形式，並在可見光下甚至在黑暗中緩慢還原。它已被用於可逆地調節所得的表面張力或表面潤溼性。
示意圖1根據自發的花色素苷-螺吡喃（MC-SP）的自發異構化作用，強制自增強表面。a）在更疏水的SP狀態和更親水的MC狀態之間的可逆轉換。b）螺旋吡喃和RGD-肽官能化聚合物（PG-SP）的合成，用於表面塗層。螺吡喃充當響應性錨定基團，而RGD肽充當聚合物塗層末端的細胞粘附配體。錨固嵌段中的疏水螺吡喃基團可以通過疏水相互作用物理吸附到疏水基質上，從而形成緻密的PG-SP單層塗層。c）自增韌聚合物塗層的方案。MC-SP塗層的自增硬性能是通過逐漸增強自發性部花菁-螺吡喃（MC-SP）異構化產生的界面粘合力來實現的。
1.螺吡喃(SP)錨的自發異構化可增強界面相互作用
通過在疏水性底物上組裝的親水聚甘油（PG）刷下方，其螺SP分子的花菁（MC）形式的錨固SP分子自發熱異構化，實現了界面相互作用的自增強。烷基化玻璃作為模型表面）。親水性PG嵌段具有高度的生物惰性，可防止蛋白質和細胞的非特異性吸附。模仿纖連蛋白整合素結合位點的整合素結合基序RGD（cycloRGDfK）PG刷使細胞能夠直接檢測聚合物塗層的物理性質（示意圖1）。
在嵌段選擇性溶劑（例如H2O）中，PG嵌段的良溶劑，而SP基團的嵌段溶劑不良，疏水性SP錨定基團迅速吸附到疏水性底物上（圖1a），從而形成頂部帶有緻密的聚合物刷單層塗層，帶有細胞粘合劑配體。原位UV輻射將SP形式異構化為更親水的MC形式，從而生成在疏水性基材上具有較弱錨固力的PG-MC塗層。在異構化和隨後用PBS緩衝液衝洗的過程中，未檢測到明顯的聚合物分離現象（圖1a）。此外，通過紫外線照射後用水接觸角測量檢測到的聚合物塗層的潤溼性沒有變化，並用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）衝洗（圖1b）。SP和MC兩種形式的聚合物刷均具有相同的表面粗糙度和形態（圖1c），在MC–SP異構化過程中甚至沒有變化。固態上的紫外線照射（365 nm，30 mW cm-2）5分鐘後，錨定分子的形成發生了變化並迅速達到平衡（圖1d）
圖1 響應性螺吡喃基表面具有自增強的界面相互作用力。
2. 自增強的粘附力介導細胞粘附
首先研究了生物界面上的自增強粘附力對細胞粘附的影響。 在細胞粘附的早期階段（4 h），SP表面的細胞擴散面積高於MC–SP表面的細胞擴散面積。這種差異在24小時後逐漸消失並逆轉（圖2a，b）。與細胞擴散區域相反，在早期（4 h）或成熟（24 h）粘附階段，自增強MC–SP表面上的粘著斑（FA）面積和細胞長度大於靜態SP表面上的（圖2c–e）。這表明與普通靜態表面相比，動態表面上的細胞粘附機制不同，在靜態表面上，細胞更傾向於粘附在具有更大擴散面積和FA尺寸的剛性基材上。
圖2 細胞粘附在SP和MC-SP表面上。
3. 自增強粘著力可促進細胞內張力和MSC成骨分化
細胞內張力是細胞機械轉導的關鍵因素。肌球蛋白II是主要的運動蛋白，負責細胞骨架張力的產生。因此，作者通過免疫染色肌球蛋白II（Ser1943）分析了力量自我增強對肌球蛋白II活性的影響。在粘附的早期階段（4小時），當MC-SP表面的錨定基團主要處於MC狀態時，與靜態SP表面相比，自響應MC-SP表面上的細胞表現出相對較低的肌球蛋白II活化。這表明由於SP錨的強粘附力，靜態SP表面上的細胞在此時間點保持較高的肌動球蛋白收縮性（圖3a，b）。自增強過程（24小時），即MC到SP異構化後，MC-SP表面上細胞的肌球蛋白活性明顯增強，並達到比靜態SP表面上更高的水平。
圖3自增強表面上的細胞張力和幹細胞成骨分化。
4. 細胞對自增強粘附力的反應取決於不同的整合素類
整合素與粘附配體（cycloRGDfK，對α5β1和αvβ3整合素具有特異性）的識別和結合將細胞與微環境聯繫起來並啟動機械轉導過程。作者在最近的研究中證明，細胞通過α5β1整聯蛋白以細胞內不依賴於張力的方式感知可擴散的配體，而通過α5β1和αvβ3整聯蛋白的協作感知靜態配體。為了了解在動態MC-SP表面上自增強粘附力誘導的機械轉導和細胞成骨分化的機制，因此，作者著重研究了α5β1和αvβ3整合素在MC–SP表面上對細胞粘附和細胞內張力產生的作用。
為了檢查α5β1和αvβ3整聯蛋白在檢測配體錨定基團強度中的作用，在粘附初期（4小時）以錨定基團主要在MC中用α5β1整聯蛋白和αvβ3整聯蛋白的封閉抗體處理細胞。狀態在MC–SP表面上。在α5β1整合素阻斷後，SP表面和MC–SP表面上的細胞擴散面積均明顯減少（圖4a，b）。如圖4c，d所示，通過阻斷α5β1整聯蛋白，將FAK（Y397）的磷酸化在MC–SP表面上的抑制程度比在SP表面更強，而通過阻斷αvβ3整聯蛋白的抑制則在SP表面上的抑制程度更大。因此，在這個早期的粘附期中，α5β1和αvβ3整合素分別對MC-SP和SP表面上的細胞張力產生貢獻更大。
圖4整合素類介導細胞對自身增強粘附力的機械反應。
順序的Rac和RhoA/ROCK信號調節細胞對自身增強粘附力的機械響應：Rho家族的GTPases是分子開關，可介導多種信號轉導途徑並調節真核細胞中的多種生物學過程。已有研究表明，可擴散的配體通過Rac信號誘導力依賴性細胞粘附，而靜態配體通過RhoA / ROCK信號引發力依賴性細胞粘附。因此，作者研究了Rac和RhoA / ROCK信號傳導對細胞自我增強反應的功能。在細胞黏附的早期階段（前4小時，MC–SP表面錨定在MC狀態），Rac抑制（使用NSC23766）而不是ROCK抑制（使用Y27632）限制了細胞在MC–SP表面的擴散（圖5a，b ）。相反，SP表面的細胞粘附對ROCK抑制而不是Rac抑制敏感（圖5a，b）。此外，在細胞擴散早期，MC-SP表面清楚地觀察到了Rac誘導的片狀脂血症（圖5c，d）。這表明弱的MC錨激活了基於Rac的lamellipodia樣細胞粘附，而強的SP錨激活了基於RhoA/ROCK的典型力依賴性粘附。作者進一步分析了自增強力（即錨基團的MC–SP異構化）是否可以重新啟動基於RhoA / ROCK的粘附。正常生長24小時後，用Y27632處理細胞3小時。在MC-SP和SP表面上的細胞擴散面積均下降到相同水平（圖5e，f），表明在動態MC-SP表面上依次激活的Rac和RhoA / ROCK信號傳導。
圖5 自增強的粘附力通過順序的Rac和RhoA/ROCK信號傳導調節細胞的機械傳導。
【通訊簡介】
魏強，國家「海外高層次人才引進計劃」（第十四批）特聘研究員，國家優秀自費留學生獎獲得者，其博士論文獲得德國最高等級拉丁文學位榮譽Summa Cum Laude（<1%）。歸國前擔任馬普醫學研究所與柏林自由大學聯合研究項目組長。
主要從事細胞力學響應與界面生物材料相關研究工作，具備材料學、化學、生物學複合背景，在高分子化學與材料表面改性，以及細胞粘附與力學信號轉導等領域均有充分的研究經歷。在Nano Letters、ACS Nano、Angewandte Chemie International Edition、Advanced Materials、Advanced Science等主流雜誌上發表論文50餘篇，論文引總數超過2500次，H-index為23。其中通訊作者與一作者論文20餘篇，總影響因子>250，平均影響因子>10，多篇進入ESI高被引論文，單篇最高引用>450。另授權專利3項。擔任國際期刊Smart Materials in Medicine與Biosensors編委，擔任Frontiers in Bioengineering and Biotechnology、Polymers等期刊的客座編輯，並為ACS、RSC、Wiley、Elsevier等多個主流資料庫的眾多SCI雜誌審稿人，多次受邀為仲裁審稿人。
參考文獻：
doi.org/10.1002/adma.202006986
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