今天給大家分享2018年5月Science(IF=41.037)雜誌上的文章」Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease「。在這篇文章中作者利用了單細胞測序注釋了小鼠腎臟的細胞類型，以及證明了假設：相同表型的單基因遺傳性腎臟疾病來自相同的細胞類型，同時作者還證明了發現一種新的集合管細胞類型，並進一步用轉基因小鼠、免疫螢光等方法證明了其為IC和PC的一種過渡狀態的細胞，且由Notch通路調控，可能與代謝性酸中毒有關。
Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease
小鼠腎臟的轉錄組學單細胞測序揭示了腎臟疾病的潛在細胞靶點
一.研究背景
腎臟是由多個部分組成的進行多種複雜功能的器官。其中，腎小球可過濾血液產生水和溶質；近端小管進行重吸收功能，重新大量的水和電解質；Henle環主要涉及溶質的濃縮；遠端小管和集合管調節溶質運輸。在腎臟中目前僅有有少量的基因被注釋，因此通過單細胞測序並進行聚類，可以重新定義腎細胞類型，且有助於發掘出新的腎細胞類型，同時有利於發掘出腎臟疾病的機制。另外使用單細胞測序分析可以識別相同的細胞類型以及區分原代細胞和傳代細胞。
二.分析流程
三.結果解析
1.小鼠腎臟細胞的單細胞測序和無偏聚類
圖1A：對7隻小鼠全腎細胞懸液的57,979個細胞進行分離和測序，同時進行質量控制（過濾線粒體基因超過50%）後進一步分析43,745個細胞，隨後進行無偏聚類得到16個細胞簇，並確保來自7個腎臟的細胞平均分布在16個細胞簇中。圖S2：確定質量控制的閾值以排除線粒體基因的影響：tSNE圖顯示線粒體基因表達的百分比（圖S2A ）；所有基因進行無偏聚類生成的tSNE圖（圖S2B）；展示圖S2B集合管細胞標記的表達（圖S2C）；過濾線粒體基因超過20%的tSNE圖（圖S2D）；展示圖S2D集合管細胞標記的表達（圖S2E）圖S3：對線粒體高表達基因使用GO富集分析，發現線粒體高表達基因和線粒體編碼蛋白相關用於溶質運輸，而非細胞應激反應，同時表明線粒體基因表達增加是腎臟細胞特有的類型圖S4：通過兩種不同方法識別細胞類型進行驗證，第一種為對表達基因進行PCA，後對排名前20的PCs進行tSNE分析；第二種為對表達基因進行PCA，然後選擇排名前100或後100的基因進行tSNE分析
圖1. 腎臟細胞的分類和注釋
圖S2S3. 質量控制（排除線粒體基因表達的影響）
圖S4. PCA驗證分類結果
2.基於細胞類型特異性標記基因對腎細胞的分類
圖1B：通過表達差異基因分析和IHC分析，得到每個細胞簇的特異性標記基因，且這些標記基因大多為已知的基因如：Kdr、Nphs1、Nphs2、Slc12a1和Slc12a3；但仍有少數額外的標記物此前未發現如：Cdkn1c和Bcam。圖1C：進一步分析細胞簇1、3和7，得到了8個亞群，其中細胞簇1可以分成內皮細胞亞群、周細胞/血管平滑肌/腎小球樣細胞亞群和髓襻細胞降環亞群；細胞簇3（近端小管）分為S1、S2和S3；細胞簇7（閏細胞）可分成A型和B型。圖S8：通過單細胞測序與不同腎節段bulk RNA sequence 的相關性分析驗證注釋結果圖S9：通過單細胞測序與免疫細胞類型微陣列數據（數據來源Immunological Genome Project）的相關性分析驗證注釋結果圖S10：使用綠色螢光蛋白（GFP）標記足細胞、內皮細胞和腎小管細胞驗證分類因此，作者通過單細胞轉錄測序定義了18種已知的腎細胞類型和3種新的細胞類型
圖S8. 外部數據驗證注釋結果
圖S9. 外部數據驗證注釋結果
圖S10. 螢光蛋白驗證注釋結果
3.單基因遺傳病致病基因具有細胞類型特異性
圖2A：對於29個人類蛋白尿單基因遺傳相關基因，有21個且僅在小鼠的一種細胞類型（腎小球足細胞）中表達。同時，人體中的腎小管性酸中毒相關基因僅在集合管閏細胞表達；涉及血壓的基因僅在遠曲小管或僅在集合管的主細胞中表達；慢性腎病和血漿代謝物水平相關基因在近端小管中表達。因此，作者得出結論：相同表型的單基因遺傳性腎臟疾病來自相同的細胞類型。
圖2. 在小鼠中人類單基因遺傳病致病基因表達情況
4.腎臟集合管鑑定出新型細胞類型
圖3AB：腎臟集合管由於起源於輸尿管芽，因此至少存在三種的細胞類型：主細胞（PC）負責鈉、水重吸收和鉀分泌；α閏細胞（A-IC）負責酸分泌；β閏細胞和（B-IC）負責鹼分泌。作者使用水通道蛋白2（Aqp2）和H + -ATP酶亞基（Atp6v1g3）來定義PC和IC細胞。並且在細胞簇8中Aqp2和Atp6v1g3標記基因同時表達陽性。圖3C：使用AQP2和ATP6V1B1免疫螢光染色，驗證Aqp2和Atp6v1g3基因在細胞簇8表達。圖3DE：對3種PC、IC和雙陽性細胞進行原位雜交並表達差異分析，展示三個細胞簇基因表達情況.圖3F：對新發現的細胞進行PARM1（IC特異性）與AQP2或ATP6V1B1雙重染色，證明細胞簇8為雙陽性的細胞。圖3G：使用Monocle進行偽時間分析，發現細胞簇8為形成PC和IC的中間狀態的過渡細胞。因此，腎臟集合管中不但包含PC和IC細胞也包含了過渡狀態的細胞。
圖3. 鑑定出IC和PC轉化過程中過渡狀態的細胞
5.螢光譜系追蹤證實集合管細胞的可塑性
圖3HI：為了在小鼠體內驗證集合管具有細胞簇8的過渡細胞，作者構建帶有Aqp2譜系標籤的主細胞和帶有Atp6標籤的閏細胞的小鼠進行譜系追蹤實驗，並成功證實在小鼠體內PC和IC細胞互相轉化。圖S18:圖A通過tSNE圖展示各個細胞簇的細胞周期，其中灰色虛線為細胞簇678，沒有處於有絲分裂間期；圖B展示細胞周期相關蛋白富集的細胞簇，細胞簇8不富集；圖C在IC和PC轉化細胞軌跡圖上，沒有細胞周期相關蛋白富集，因此，新發現的細胞不為IC和PC的祖細胞。
S18. 排除新的細胞類型為祖細胞的可能
6.Notch通路調控集合管細胞的可塑性，導致慢性腎臟疾病出現中異常的細胞群
圖S19：作者進一步分析了IC與PC在細胞轉化過渡過程中表達差異的基因。圖S19A展示基因表達展示了差異基因；圖S19B展示不同表達的標記基因；圖S19C展示了差異基因的功能。
S19. 鑑定IC與PC轉化過程的差異基因
圖4A：進一步分析差異基因發現Notch信號通路被激活，其中PC中Notch配體低表達，而IC中高表達圖4B：通過免疫螢光實驗，展示了Notch配體JAG1在IC細胞表達，同時其排斥Aqp2表達。圖4C：構建了Notch過表達的小鼠，在小鼠中PC細胞增加，IC細胞減少圖4D：通過去卷積分析RNA數據驗證了IC與PC比例。因此，Notch的表達驅動IC到PC細胞的轉變。圖4EG：在葉酸處理的小鼠導致IC細胞和PC細胞無法相互轉換，因此AQP2 +細胞增加，而ATP6V1B1 +細胞。圖4F：通過反卷積分析RNA數據驗證了葉酸處理IC與PC比例。圖4H：對CDK患者的腎臟活檢的反卷積分析，Notch信號和HES1表達增加。圖4I：葉酸誘導的小鼠CDK模型，血液CO2水平降低。因此，IC向PC的轉變是由Notch配體（IC）和受體（PC）的表達介導的；在小鼠模型和CKD患者中，IC向PC細胞的轉變可能是引起代謝性酸中毒的原因。
圖4. Notch通路介導IC向PC轉變
小結
最後小結一下，作者使用單細胞測序和無偏聚類對來自健康小鼠腎臟的57,979個細胞構成的16個基因簇進行了注釋。基於基因表達模式，作者推斷遺傳的腎臟疾病源於不同的基因突變，但相同表型的單基因遺傳性腎臟疾病來自相同的細胞類型。作者還鑑定出成年小鼠的腎臟集合管的新型的過渡細胞，隨後通過計算細胞軌跡分析和體內譜系追蹤顯示，閏細胞（IC）和主細胞（PC）是由Notch信號通路介導的轉變，存在過渡狀態的細胞，且可能與代謝性酸中毒有關。
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編輯：蝦餃皇
校審：科研菌