培養液能提供胚胎生長最重要的物質環境,其含有多種胚胎發育所需的營養。現今,商品化的培養液已被證實能很好地支持人類胚胎體外正常發育和生長(見圖01)。
此外,小鼠胚胎檢測(MEA)能有效地驗證培養液的有效性。市場上的胚胎培養液在上市前都經過MEA的驗證,即在有效培養系統下,小鼠胚胎在體外能獲得與體內相似的發育速度與質量(見圖02),以此證明培養液的安全性和有效性。
圖01: 從卵裂到囊胚
圖02: 體外培養第五天的小鼠胚胎
人類培養液的配方和質量在過去四十年中逐步優化和提高,優質胚胎和囊胚的形成率因此不斷提升,進而提高了妊娠率。與此同時,專家們對培養液存在兩種不同的配方策略,即序貫培養液和單一培養液。
序貫培養液基於「回歸自然」的理念,讓胚胎獲得不同生長時期所需的不同營養成分,因此專家們針對胚胎體外培養的不同階段配製了不同配方的培養液,即卵裂培養液和囊胚培養液(以下是兩種不同培養液的成分配比)。
氯化鉀,氯化鈣,硫酸鎂,碳酸氫鈉,氯化鈉,磷酸二氫鈉,乳酸鈉,丙酮酸鈉,葡萄糖,透明質酸,青黴素,人血白蛋白,丙氨酸,丙氨醯穀氨醯胺,天冬醯胺,天冬氨酸,乙二胺四乙酸,穀氨酸,甘氨酸,脯氨酸,絲氨酸,牛磺酸等。
氯化鈣,泛酸鈣,硫酸鎂,氯化鉀,碳酸氫鈉,氯化鈉,磷酸二氫鈉,乳酸鈉,丙酮酸鈉,葡萄糖,透明質酸,青黴素,人血白蛋白,鹽酸吡哆醛,核黃素,硫胺,丙氨酸,丙氨醯穀氨醯胺,精氨酸,天冬醯胺,天門冬氨酸,胱氨酸,穀氨酸,甘氨酸,組氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,賴氨酸,蛋氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,絲氨酸,蘇氨酸,色氨酸,酪氨酸,纈氨酸等。
從上述成分信息中,我們能對比出兩種培養液既有相同部分,也存在差異,以滿足胚胎在不同階段的營養需求。
單一培養液則秉持「讓胚胎選擇」的培養策略,即提供胚胎體外培養整個進程中所需營養物質,讓胚胎在發育的過程中自行選擇吸收哪種營養物質,減少非必要的人為幹預。
當然無論選擇哪種策略的培養液,其目的均是為了胚胎能更好地存活,專家們通過小鼠試驗和臨床研究發現相對低的代謝水平有助於胚胎存活,並總結了以下情況最利於種植前胚胎的存活。
整體代謝水平最低(限度尚待確定)
最低糖酵解率(小鼠研究成果)
最低胺基酸周轉率(人類研究結果)
抗氧化酶水平高
綜合以上情況,我們能大致總結出幾條胚胎培養液的設計思路:
01. 胚胎應該在相對安靜代謝的培養基中,而不是相對活躍的胚胎代謝。
02. 營養物質的濃度可能需要保持相對低水平。
03. 胚胎體外發育時,通過提供底物,引導胚胎採用相應的代謝模式來利用內源性營養物質。
依據以上設計思路,專家們對其中的「營養物質的濃度可能需要保持相對低水平」進行了前瞻性臨床論證,即對比兩種不同乳酸水平的培養液(兩者乳酸水平相差6倍)在年齡23-40歲的107名患者中的使用效果,得出的結論是在低乳酸培養基中培養的胚胎移植、妊娠和持續妊娠的比例更高(見下圖)。
高乳酸的培養液的囊胚形成率設置為100%,其它數據為相對值
專家們進一步發現細胞內pH值的輕微變化可以顯著影響胚胎發育和生存能力,而在體外受精培養環境下的pH值主要由培養箱提供的可調二氧化碳濃度和培養液中的碳酸氫鹽濃度來調節,即在已設定碳酸氫鹽濃度的培養液中,通過調節培養箱中二氧化碳濃度來調節pH值,兩者成反比關係。
二氧化碳調節pH值的反應方程式
而通過以下小鼠對比試驗,我們能嘗試找出更適合體外受精培養的pH值。
採用小鼠卵母細胞與精子進行體外受精,然後將受精後的胚胎置於培養液中培養,分別將培養液的pH值設在7.05、7.20、7.35、7.50、7.65,觀察、計數D1天受精率、D2天卵裂率、D4天囊胚形成率、D5天囊胚孵出率,應用雷射共聚焦顯微鏡觀察胚胎紡錘體的改變情況。
培養箱內培養液pH值對小鼠體外受精及胚胎發育的幾個參數(配子受精率、卵裂率、囊胚形成率、囊胚孵出率)皆有影響。
配子受精率在pH7.50最高,pH7.05與7.20組比較有統計學差異(P<0.005),pH7.20與7.65組比較無統計學差異(P>0.005),說明在7.20-7.65之間較適合配子受精。
卵裂率在pH7.35最高,pH7.05與7.20組比較有統計學差異(P<0.005),pH7.20與7.50組比較無統計學差異(P>0.005),pH7.5與7.65組比較有統計學差異(P<0.005),說明在7.20-7.50之間較適合受精卵卵裂。
囊胚形成率在pH7.50最高,pH7.05與7.20組比較有統計學差異(P<0.005),pH7.20與7.50組比較無統計學差異(P>0.005),pH7.50與7.65組比較有統計學差異(P<0.005),說明在7.20-7.50之間較適合囊胚形成。
囊胚孵出率在pH7.35最高,pH7.05與7.20組比較有統計學差異(P<0.005),pH7.20與7.50組比較無統計學差異(P>0.005),pH7.50與7.65組比較有統計學差異(P<0.005),說明在7.20-7.50之間較適合囊胚孵出。
由上可知,胚胎的發育和生長除了受到培養液成分不同的影響之外,還受到培養箱內因二氧化碳濃度調節而變化的pH值的影響。此外,空氣的質量、溫度、滲透壓等因素也會對其產生影響。
孫海翔《培養液成分變化對胚胎發育的影響》南京鼓樓醫院
宋姝君《培養箱內溫度和pH值對小鼠體外受精及胚胎發育的影響》華北理工大學