迄今已鑑定的DNA和RNA修飾分別超過17種和160種，對這些修飾的生物學功能的興趣促使表觀基因組學（epigenomics）和表觀轉錄組學（epitranscriptomics）的建立和發展。了解特定修飾在基因組或轉錄組上的精確定位是我們解析其生物學功能的關鍵。測序技術的發展使繪製DNA/RNA修飾圖譜成為可能，但同時也引發了新的問題與思考。
近日，北京大學的伊成器團隊和牛津大學的宋春嘯團隊合作在Protein & Cell發表特邀綜述「Mapping the epigenetic modifications of DNA and RNA」，該篇綜述詳細總結了目前高通量DNA/RNA修飾檢測技術的方法和發現，包括應用三代測序在單鹼基水平鑑定修飾位點，並討論了該領域存在的問題和今後研究的方向。
DNA修飾在個體發育【1】、衰老【2】和癌症【3】中發揮了重要功能。這些修飾並不幹擾Watson-Crick配對原則，但能影響蛋白與DNA的結合。在哺乳動物基因組中，胞嘧啶的第5位碳原子的甲基化（5-甲基胞嘧啶，5-methylcytosine或5mC）是豐度最高的DNA修飾類型，也被稱為「第5種鹼基」【1】。5mC由DNA甲基化酶DNMTs催化，主要富集在CpG島。雖然5mC的分布具有組織特異性，但70-80%的CpG島都具有5mC修飾【4】。5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine或5hmC），也被稱為第6鹼基，由TET1酶氧化5mC而來。5hmC的進一步氧化產生5-甲醯基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。
與DNA類似，RNA也具有多種修飾，並且這些修飾參與了RNA代謝的各個方面。近年來利用高通量測序鑑定DNA/RNA修飾位點的技術極大地助力了表觀基因組學和表觀轉錄組學的研究。
單鹼基水平的DNA修飾位點鑑定
1. 5mC的位點鑑定
重亞硫酸氫鈉測序法（Bisulfite sequencing，BS-Seq）被認為是5mC鑑定的金標準，原理是重亞硫酸鹽不影響甲基化C，卻能將未發生甲基化的C轉變成U（尿嘧啶），後者在PCR反應中變成T，並由此將甲基化C與未甲基化C區分開；再結合高通量測序技術，即可得到單鹼基解析度的全基因組5mC修飾圖譜。重亞硫酸鹽轉換未甲基化C的效率高達99%，使得該方法的接受度最高【5-7】。然而，重亞硫酸鹽處理會導致DNA的降解【8】，限制了它在稀少珍貴樣品中的應用。另外，由於佔基因組95%的未甲基化C轉變成了T，降低了測序片段的匹配基因組的效率，也帶來了覆蓋度的偏好性。最後需要指出的是，BS-Seq並不能區分5mC和5hmC。
最近，兩種無重亞硫酸鹽的5mC鑑定方法被開發，分別是TAPS(TET-assisted pyridine borane sequencing)【9】和EM-seq（Enzymatic Methyl-Seq，EM-Seq）【10】，都利用TET酶對5mC的特異性氧化。TAPS的假陽性率比BS-Seq更低，能對少量DNA（1ng）進行檢測；且配合過氧化氫鉀可區分5mC和5hmC。EM-Seq利用了TET和DNA脫氨酶APOBEC3A，比BS-seq的靈敏度更高。
2. 5hmC，5fC和5caC的位點鑑定
深入了解5hmC、5fC和5caC的功能需要精確繪製其在基因組上的分布。oxBS-seq（Oxidative bisulfite sequencing）【11】和TAB-seq（TET-assisted bisulfite sequencing）【12，13】是改良的BS-seq，用於檢測5hmC。hmC-CATCH（Chemical-assistant C-to-T conversion of 5hmC sequencing）【14】和ACE-Seq（APOBEC-coupled epigenetic sequencing【15】則是不依賴重亞硫酸鹽的5hmC檢測方法。5fC的檢測方法包括fCAB-Seq（5fC chemically assisted bisulfite sequencing）【16】，redBS-Seq（reduced BS-Seq）【17】，MAB-Seq（methylase-assisted bisulfite sequencing）【18】和fC-CET（5fC cyclization-enabled C-to-T transition）【19】，CLEVERSeq（chemical-labeling- enabled C-to-T conversion sequencing）【20】（前三種方法是BS-seq的改良版，後兩種方法則不依賴重亞硫酸鹽）。5caC的檢測主要採用CABSeq（Chemical modification-assisted bisulfite sequencing）【21】。值得注意的是，以上列舉的測序技術都是基於化學的方法，將攜帶修飾或未被修飾的C轉換為T，從而達到區分C是否攜帶修飾以及在單鹼基水平鑑定DNA修飾位點的目的。
3. 基於抗體的DNA甲基化檢測
基於抗體的DNA修飾位點鑑定是一種傳統的，被廣泛應用的較為簡單的方法。目前5mC、5hmC、5fC、5caC均有商業化的抗體，可用於做DNA IP(DNA immunoprecipitation, DIP)。利用5hmC-DIP可鑑定癌症患者血液中循環DNA的5hmC【22】，說明此方法靈敏度高，無須耗費大量DNA，具有臨床應用的潛力。但是DIP無法提供單鹼基精度的DNA修飾分布位點，檢測特異性非常依賴抗體本身的性質，且具背景（抗體與DNA的非特異性結合）較高，因此在進行DIP時，需設置嚴格的對照，並更謹慎地對結果進行驗證。
4. DNA 6mA的測序鑑定
儘管6mA在哺乳動物基因組中的含量遠低於5mC，近年來它仍然得到了越來越多的關注。DNA 6mA的測序主要依賴6mA抗體識別攜帶該修飾的DNA片段，該方法被證明具有較高的假陽性【23】。由於6mA是細菌中豐度最高的DNA修飾類型，因此哺乳動物中6mA的鑑定極易受細菌汙染影響。雖然高精度無汙染的質譜鑑定提示哺乳動物基因組DNA 6mA含量非常低，但是最近一項研究顯示6mA富集在線粒體中並具有重要功能【24】。（近日，BioArt總結了哺乳動物6mA的研究歷程和爭議，詳見：）
不同DNA修飾的測序方法總結
RNA修飾的生物發生和鑑定
1. mRNA內部最豐富的修飾：m6A
m6A是真核生物mRNA內部豐度最高的修飾，主要由METTL3，METTL14和其他蛋白（包括WTAP, VIRMA, HAKAI, Zc3h13和RBM15/15B）組成的甲基轉移酶複合體催化【25-29】。另一個m6A甲基轉移酶是METTL16，催化MAT2A mRNA的m6A。m6A的去除由FTO和ALKBH5介導。因此m6A是一種可逆的RNA修飾。
儘管目前已有多種m6A的高通量鑑定技術，並廣泛的應用到m6A研究中，我們仍然需要對特定的檢測方法保持謹慎的態度。基於m6A-seq技術可能由於m6A抗體的非特異性結合造成假陽性。最近，有研究者開發了非抗體依賴的m6A檢測方法，採用特性的核酸內切酶識別攜帶m6A的序列【30，31】，然而由於內切酶的活性限制，該方法僅能識別一部分m6A motif。而基於化學標記的m6A鑑定方法【32，33】則極大地受化學反應效率的影響。因此，新m6A鑑定方法的開發仍有重要意義。
越來越多的證據支持m6A在生命活動中的重要性，但同時引發了許多疑問。1）FTO的底物和功能。許多研究將FTO作為m6A去甲基化酶開展功能研究，然而實際上FTO被證明有多種催化底物（包括mRNA 的m6A和m6Am,tRNA的m1A和snRNAm6Am等）（），目前還不清楚FTO如何選擇和調控不同的底物並在細胞活動中發揮功能。2）m6A在可變剪接中的功能。雖然m6A甲基化酶，去甲基化酶和閱讀蛋白都能影響可變剪接【34-36】，但有研究發現在mES中m6A對RNA剪接不是必需的【37】。因此，有關m6A如何直接或間接影響剪接事件，還需進一步研究。3）m6A在抗病毒反應中的功能。目前研究發現m6A可以修飾寨卡病毒（ZIKV）、C型肝炎病毒（HCV）、A型流感病毒（IAV）和人免疫缺陷病毒（HIV）的RNA（新冠病毒RNA也存在豐富的修飾，詳見此前報導：）。m6A可以抑制ZIKV病毒的感染【38】，但能促進IAV病毒的表達【39】。然而目前對m6A如何調控病毒RNA命運，以及為什麼對不同病毒的作用不同，還不清楚。
2. m6Am修飾
當真核生物mRNA 5『帽子後的第一個A攜帶2-O-甲基化（Am）時，可以被甲基化酶PCIF進一步催化為m6Am。然而目前m6Am的測序鑑定方法都基於使用m6A抗體（m6A抗體可識別m6A和m6Am），再輔以其他分析。因此，還需開發更特異的m6Am鑑定方法。另外，m6Am的功能還有較大爭議。m6Am最開始被鑑定為與RNA穩定性相關【40】，而後的研究發現m6Am僅影響一小部分的mRNA的半衰期【41】，m6Am還可以影響mRNA的翻譯效率【42】。因此，關於m6Am對mRNA命運決定還需進一步研究。
3. m1A修飾
m1A是m6A的異構體，甲基被連接到N1而不是N6位。m1A富集在tRNA，rRNA和mRNA上。甲基轉移酶複合體TRMT6-TRMT61A介導mRNA上的m1A，而另一個複合體TRMT61B 和TRMT10C介導線粒體mRNA上的m1A。m1A的去甲基化由ALKBH1,ALKBH3和FTO負責。
最近，多個獨立課題組開發了的高通量測序方法（包括m1A-ID-Seq【43】, m1A-Seq, m1A-MAP【44】和m1A-Seq-TGIRT【45】），然而這些方法在mRNA上僅鑑定到幾十個到幾百個m1A位點，而質譜顯示m1A/A約為0.01~0.05%，這提示mRNA上的m1A位點應有上千個，也說明現有的m1A鑑定技術的靈敏度有限。
4. m5C，hm5C和ac4C修飾
tRNA, rRNA和mRNA均有m5C修飾，其中mRNA上的m5C由NSUN催化。借鑑DNA 5mC的鑑定方法，m5C也可採用改良的重亞硫酸鹽測序法進行單鹼基精度的鑑定【46,47】，但同樣會面臨RNA降解的問題。Aza-IP和miCLIP是無需重亞硫酸鹽處理的m5C鑑定方法，但需要過表達甲基化酶，這可能導致假陽性以及不能真實反映真實條件下m5C的分布。目前hm5C和ac4C的鑑定都依賴於相應的抗體，無法達到單鹼基精度。因此，我們期待未來能有準確性更高的m5C，hm5C和ac4C檢測方法。
5. 假尿嘧啶Ψ修飾
假尿嘧啶Ψ被認為是RNA的第5個鹼基，是RNA上最豐富的修飾類型，主要集中在tRNA，rRNA，snRNA和mRNA上。假尿嘧啶的生成依賴兩類假尿苷合成酶（pseudouridine synthases，PUSs）：「stand-alone」 PUSs不需要共因子（cofactor），而RNA依賴的PUSs需要H/ACA box snoRNA幫助識別靶RNA。由於假尿嘧啶與N-cyclohexyl-N』-β-(4-methylmorpholinium) CMC（ethylcarbodiimide）反應會生成CMC-Ψ，影響逆轉錄反應，研究者們根據這一特點開發了CeU-Seq【48】。目前已在mRNA上鑑定了約2000個假尿嘧啶位點，而根據質譜檢測結果，mRNA上的假尿嘧啶修飾豐度應該和m6A相當【49】。
6. m7G修飾
m7G是tRNA和mRNA 5『帽子的經典修飾，而最近的研究表明在mRNA內部也存在m7G修飾。METTL1-WDR4複合體是可將m7G加到tRNA和一部分mRNA內部。目前已有基於抗體和化學方法的m7G檢測技術（m7G-MeRIP-Seq【50】和m7G miCLIPSeq【51】）。得益於這些技術，mRNA內部的m7G被認為與翻譯相關。但是，考慮到m7G在tRNA上的富集，今後的研究還需更謹慎的區別m7G在不同RNA上的功能。
不同RNA修飾的結構及其相關測測序鑑定方法總結
長讀段測序在DNA/RNA修飾檢測中的應用
上述提及的測序技術都被測序長度限制，而三代測序可以進行長片段的讀取，並且具有直接獲取DNA/RNA修飾（無需抗體或化學處理）的潛力，具有重要意義。修飾會改變核苷酸匹配的效率，SMRT測序通過檢測不同螢光標記的dNTP/NTP結合目標核苷酸的時間差異來計算單核苷酸精度的修飾【52】。同時，修飾也會改變核苷酸的電信號，而Nanopore測序通過檢測核苷酸通過納米孔徑的電信號來計算攜帶的修飾【53】。雖然這兩種三代測序技術具有很好的應用前景，但目前的計算方法和技術還存在較高的假陽性，需要進一步改進和提升。
總結和展望
總的來說，DNA/RNA修飾的鑑定技術在不斷更新，向我們展示了DNA/RNA修飾在生命活動中的重要功能。但未來仍需要準確度更高，更負擔得起的檢測方法對修飾位點進行單鹼基精度的檢測，以便我們解析這些修飾如何影響RNA命運並參與各種生理過程。
原文連結：
https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s13238-020-00733-7.pdf
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本文轉載自公眾號「BioArt」（BioGossip）
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原標題：《【科技前沿】伊成器、宋春嘯等全面總結DNA和RNA修飾的檢測方法和研究困境》
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