編者按：圍繞DNA新修飾6mA的爭議巨大，BioArt編輯部在廣泛聽取了十多位海內外專家的意見的基礎上專門對整個研究歷程以及爭議進行了回顧和描述，本著對科學負責的態度，BioArt編輯部保持了最大的獨立性完成此文，全文8000多字，歷時一年左右完成。儘管爭議還在繼續，但是相信這篇文章對關心和希望了解6mA領域的讀者有一定的幫助，至於是非曲直，留給讀者去思考和判斷。
DNA上的新修飾6mA。圖片引自：https://phys.org/news/2015-05-dna-modification-inheritable.html。Credit: Lei Chen
撰文 | 小柚
責編丨丁廣進
DNA甲基化是最早被發現，也是目前研究最深入的表觀遺傳調控機制之一。哺乳動物中最主要的DNA修飾是5mC（5-甲基胞嘧啶），佔人類DNA中總胞嘧啶的3%~6%【1】。相反，5mC在原核生物中很少，而6mA（N6-甲基腺嘌呤，對應RNA上的修飾成為m6A，請讀者注意區分）則是原核生物中最具代表性的DNA修飾，主要參與限制-修飾系統（restriction-modification），保護個體免受外來DNA的侵入。儘管哺乳動物中缺乏已知的限制-修飾系統，但近年來的研究在真核生物，甚至包括哺乳動物和植物基因組中鑑定到了6mA，並發現6mA在生長發育和疾病調控中具有重要作用。這些研究掀開了真核生物表觀遺傳修飾的新篇章。但同時，隨著關注的增加，不同的聲音也不斷被發出，一場圍繞真核生物中DNA 6mA修飾的相關爭議早已拉開帷幕，而最為激烈的是關於哺乳動物基因組中是否存在6mA的爭議。
一、 「繁花似錦」——真核生物中6mA的鑑定歷程
2015年，Cell連發3篇研究（入選當期Cell雜誌的封面論文），首次報導藻類【2】、果蠅【3】和線蟲【4】的基因組中具有6mA修飾， 並配同期評論「An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine【5】」，認為真核生物中6mA的發現，將賦予6mA研究的第二次生命。
Cell雜誌的封面。Image design by Lena Kay.
僅過去一年，2016年Nature發表研究報導6mA在小鼠胚胎幹細胞中存在，並參與轉座子活性的調控，同時鑑定了ALKBH1為6mA去甲基化酶【6】。
6mA在真核生物中的鑑定研究，不少論文登上Top期刊，足以說明6mA帶來的驚喜和受到的巨大關注。
隨後，越來越多的研究團隊加入6mA研究。
2018年7月，Molecular Cell發表利用SMRT測序首次獲得人類細胞的DNA 6mA修飾圖譜的研究，證明6mA在人類基因組（包括線粒體基因組）中廣泛存在，並且癌組織中6mA的豐度顯著低於正常組織，同時鑑定了N6AMT1為6mA甲基化酶【7】。（詳見BioArt報導：Mol Cell丨晏光榮肖傳樂等合作解碼人類基因組新型甲基化修飾）。4個月後，Cell發表6mA在神經膠質瘤中的研究，發現6mA在腦癌幹細胞中的含量高於正常神經組織，並且靶向6mA去甲基化酶ALKBH1有望成為治療該類癌症的新策略（詳見BioArt報導：Cell丨謝琦博士等揭示DNA新修飾6mA在神經膠質瘤中的作用）【8】。
同時，植物6mA研究也在如火如荼的進行，勢頭不亞於6mA在人類中的研究。2017年，水稻和擬南芥基因組中6mA修飾圖譜於2018年分別發表在Nature Plant【9】，Molecular Plant【10】和Development Cell【11】。
不僅科學研究者們看到了6mA的潛力，多家測序公司也嗅到商機，聲稱可開展6mA測序鑑定服務，繪製特定體系中的6mA圖譜 。
參考RNA m6A被證明廣泛存在於mRNA並參與多項生命活動進程後的火熱程度，許多研究同行預見DNA 6mA可能將成為表觀遺傳領域的熱門新領域！
二、「針鋒相對」——6mA的鑑定爭議
雖然6mA在高等真核生物中的研究看起來花團錦簇，但我們仍然難以繪製6mA分布圖譜和了解它的生物學意義，這是因為不同研究中6mA的豐度，分布和功能在有巨大差異。在植物和真菌中，6mA主要富集在基因轉錄起始區，與轉錄激活有關，豐度在0.05%至2.8%【2，11】。在脊椎動物中，6mA主要富集在轉座子區【6】、異染色質區【8】甚至基因編碼區【7】；而6mA的豐度在不同哺乳動物和組織中竟相差10000倍（0.0001%~1%）【7, 8，12-14】！
這些差異，特別是6mA的豐度差異，是由於物種或組織特異性造成的？還是由於實驗手段和方法的差異造成的？當6mA的豐度為0.0001%時，相當於每百萬個腺嘌呤核苷酸（A）僅有10個攜帶6mA修飾，這樣低的豐度，真的具有生物學功能嗎？是否是檢測時的汙染？
關於真核生物是否真的具有6mA修飾，學界一直存有爭議。
Schiffers S和Ratel D等分別在Angew Chem Int Ed Engl【9】和FEBS Lett【10】發表研究直言小鼠中不存在6mA修飾。但這兩項研究並未引起太大關注。
2019年6月，波士頓兒童醫院的Eric L. Greer博士在BMC Genomics發表研究 「Sources of artifact in measurements of 6mA and 4mC abundance in eukaryotic genomic DNA」，該研究發現由於檢測技術中存在汙染，目前大部分研究都高估了真核生物中6mA和4mC的含量。質譜檢測（UHPLC-MS/MS，ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry）是各類修飾鑑定的金標準。在DNA 6mA的質譜檢測中，需要使用核酸酶和磷酸酶將待檢測DNA消化成單個脫氧核苷酸分子，而目前使用最廣泛的核酸酶和磷酸酶都來源於細菌。細菌中含有高豐度的6mA，這可能使這些酶攜帶6mA。
確實，研究者檢測了目前市面上3款常見的核酸酶和磷酸酶:Nuclease P1，Nuclease S1和DNA degradase plus，發現它們均含有6mA修飾的汙染。當採用這些酶處理的水作為對照，並將其中6mA含量設置為背景值時，研究者發現包括線蟲（這也提示研究人員，基於線蟲體系圍繞6mA開展的進一步深入研究所得出的結論【19】也需要重新審視），小鼠和人在內的多個物種，6mA含量非常低，甚至檢測不到（< 0.00003% for 6 mA）。
這說明6mA在某些哺乳動物中的高豐度，是由細菌汙染造成的；當排除細菌汙染後，6mA在哺乳動物中的含量非常非常低。（值得注意的是，該研究的通訊作者Eric L. Greer之前是施揚教授的博士後，也是2015年在Cell線蟲中6mA鑑定研究的第一作者。雖然BMC Genomics雜誌的影響因子不高，但該研究的作者中有施揚和何川兩位領軍人物的名字，足以說明他們對該研究提及的細菌汙染問題的重視。）
此外，今年3月，來自瑞典林雪平大學的Colm E. Nestor教授在Science Advance發表研究，通過多種檢測方法，嚴格的對照設置和分析，對6mA在基因組中的存在進行了全方位否定。基於6mA抗體的Dot blot和DIP-seq，質譜和基於測序方法的SMRTseq（根據甲基化修飾會影響DNA合成速度間接反應6mA的含量）是6mA檢測的最常用方法。其中，Dot blot和DIP-seq的準確性主要依賴6mA抗體的特異性。研究者採用全基因組擴增DNA(whole genome amplification DNA,WGA DNA，經PCR產生，無6mA修飾)作為陰性對照，檢測了多種組織和細胞系中6mA的含量。經檢測，它們的6mA Dot blot強度與WGA DNA（陰性對照）相當，提示6mA的含量很低。
研究者進一步分析了已發表的6mA位點和豐度研究，發現即使是相同的組織或細胞，DIP-seq和SMRTseq檢測到的6MA位點僅1~8%重合，質譜檢測到的6mA含量更是相差10~1000倍，說明這些6mA的差異是課題組的不同造成的，而不是其本身的差異。總的來說，該研究認為迄今發表的研究無法支持哺乳動物基因組中存在6mA修飾或者有高豐度。
三、 「峰迴路轉」——6mA在哺乳動物基因組中存在，但卻不是表觀遺傳標記(epigenetic mark)
6mA在人類基因組中的豐度差異，促使研究者們開發更精確，穩定和無汙染的質譜方法鑑定6mA的含量。
今年3月，來自德國IMB的Christof Niehrs教授在Nature Chemical Biology【11】發表文章發現，哺乳動物基因組中的6mA含量很低（每百萬個A中僅6~13個攜帶6mA修飾），並且這些6mA並不是由甲基化酶催化的，而是來自m6A RNA的甲基分解代謝和再利用，由DNA聚合酶將攜帶6mA的核苷酸整合到基因組中。
Nature Chemical Biology同期配了來自英國牛津大學的Paolo spingardi和skirmantas Kriaucionis對該研究的評論「How m6A sneaks into DNA」。他們指出，DNA修飾的低豐度，並不能成為我們質疑其生物學功能的論據，但是當某種修飾的含量非常稀有時（例如6mA在哺乳動物基因組中的含量），就可能使其在細胞中的功能受到挑戰。並且，6mA通過核酸代謝回收途徑被整合到基因組中，使得它難以成為一種表觀遺傳標記。對於在哺乳動物中具有重要功能的DNA 5mC修飾，細胞有一套機制嚴格地限制來自核酸分解代謝產生的5mC摻入基因組中，以確保其精確的定位。而6mA摻入基因組似乎沒有被限制，這提示6mA本身的分布（在基因組上的精確定位），可能並不重要。
4月，中國科學院的汪海林教授（2015年與陳大華教授合作在Cell發表果蠅中DNA 6mA鑑定研究）在Cell Research也發文報導6mA通過DNA聚合酶X家族成員非模板依賴的Polyλ摻入基因組中【12】。在體外實驗中，研究者將N6mdATP代替部分dATP與高保真DNA聚合酶Taq（模板依賴的聚合酶）共同孵育，發現6mA可被摻入PCR反應中；而當N6mdATP與dATP的比例降低至1：1000時，PCR產物中則檢測不到6mA，這說明N6mdATP並不是一種友好的DNA合成底物，且高保真Taq酶更傾向於使用dATP而非N6mdATP。
而在細胞周期的G1期，非模板依賴的Polyλ將6mA核苷摻入基因組；敲低Polyλ可顯著降低G1期和sub G1期6mA的水平。同時，研究者利用CRISPR敲除潛在的6mA甲基轉移酶METTL4和去甲基酶ALKBH1後（關於催化DNA 6mA的酶目前並沒有定論，還處於爭議之中），發現UPHLC-MS/MS分析方法並不支持它們是6mA相關催化酶，因為6mA的水平均未發生明顯變化（詳見BioArt報導：Cell Research | 汪海林團隊發現哺乳動物存在DNA 6mA新來源）。值得注意的是，該研究未發現DNA 6mA可通過RNA m6A代謝摻入，與前述Nature Chemical Biology論文中的結論相左。因此，關於基因組中低豐度的6mA來源，還需進一步的研究。
四、柳暗花明？6mA作為表觀遺傳標記參與線粒體生命活動的調節
目前6mA的研究不僅僅是它本身的鑑定和功能研究，更涉及到了6mA甲基化酶和去甲基化酶的鑑定，並且敲低或過表達這兩類酶，也成為研究6mA功能的重要手段。如果6mA在基因組中的含量很低，那麼這些酶在細胞中的真實底物是什麼呢？
事實上，關於6mA的甲基化酶和去甲基化酶，學界也頗多爭議。
2016年，Andrew Z. Xiao教授在小鼠中鑑定ALKBH1為6mA去甲基化酶【6】。2018年，晏光榮和肖傳樂教授則鑑定了N6AMT1作為人的6mA甲基化酶【7】。而謝琦教授等以神經膠質瘤為模型，發現N6AMT1並不具有6mA甲基化酶活性，而ALKBH1具有去甲基化酶活性（該研究為謝琦，Jeremy N. rich和Andrew Z. Xiao兩方課題組合作完成）【8】。
2019年，南加州大學醫學院的Douglas E. Feldman教授將METTL4和ALKBH4分別鑑定為6mA修飾的甲基化酶和去甲基化酶（但是並沒有提及N6AMT1和ALKBH1）（詳見BioArt報導：Mol Cell | 又見新的DNA 6mA催化酶！）。
今年2月，清華大學的李海濤教授和Andrew Z. Xiao教授，中國農業大學的陳忠周教授與中科院生物物理所閆小雪分別在Cell Research發表研究，解析了ALKBH1作為哺乳動物DNA 6mA去甲基化酶的自由態以及與DNA底物結合後的複合物結構及工作機制（詳見BioArt報導：Cell Research背靠背 | 李海濤、陳忠周團隊分別發文揭示哺乳動物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作機制）。
蛋白結構是功能的基礎，結構解析往往為我們了解蛋白提供了「眼見為實」的證據。由此，雖然6mA甲基化酶尚存爭議，但似乎ALKBH1是6mA去甲基化酶，至少在體外實驗中證明ALKBH1是6mA去甲基化酶。而6mA在哺乳動物基因組中的含量非常稀少，ALKBH1作為去甲基化酶，能發揮多大的生物學功能呢？一時間，疑問更多了。
今年3月，芝加哥大學的何川教授在Molecular Cell發表的研究為6mA研究提供了新的方向【15】（詳見BioArt報導：Mol Cell | 何川團隊揭示哺乳動物線粒體DNA中6mA修飾的存在和功能）。該研究發現哺乳動物中的6mA修飾主要集中在線粒體DNA上（平均每個mtDNA分子有4個6mA），而核基因組DNA的6mA量極低。
同時，研究者鑑定了主要定位在線粒體中的METTL4，是6mA的甲基轉移酶（這與南加州大學醫學院的Douglas E. Feldman教授的結論一致，但他們當時認為METTL4介導核基因組的6mA修飾，但是該結果與最近施揚教授團隊發表在Cell Research上的結果相左，施揚團隊證明METTL4催化的底物是RNA而不是DNA）。6mA阻礙線粒體轉錄因子結合mtDNA，從而減弱mtDNA的轉錄和拷貝數（mtDNA copy number）。在低氧情況下，6mA的水平上升，提示6mA與線粒體壓力應答過程相關。
那麼，ALKBH1是否定位在線粒體中並發揮mtDNA 6mA去甲基化酶的功能呢？已有研究表明ALKBH1可以定位在線粒體中，功能包括調控線粒體tRNAMet的2』-O-甲基化【15】，線粒體RNA granule的形成【16】和拷貝數【17】等。而關於ALKBH1是否調控mtDNA 6mA尚不清楚。
綜上，關於N6AMT1和ALKBH4，ALKBH1的功能，它們真正的催化底物，都需要進一步研究。
五、雄關漫道真如鐵，而今邁步從頭越
從2015年首次在真核生物中被鑑定到如今5年多的時間裡，6mA獲得了廣泛的關注，也引發了激烈的爭議。我們對6mA的態度也從期待變成了審慎。6mA在哺乳動物中的低豐度，與其高度的動態性有關嗎？由DNA聚合酶摻入的6mA是隨機分布的嗎？是否具有生物學功能？目前鑑定的m6A相關催化酶，是真實的嗎？
目前的表觀遺傳研究為我們回答這些問題，提供了一些線索，當然也引發新的疑問。
1）6mA的高度動態性；
在果蠅胚胎中，6mA的豐度在胚胎發育的0.75h內達到頂峰（~0.07%，6mA/dA），而後迅速降低，4h後僅剩~0.001%【3】，另外兩篇文章也提到了斑馬魚的豬的胚胎發育過程以及小鼠應對環境變化中DNA 6mA具有高度動態性【20，21】，由此可見，6mA的豐度呈高度動態性，對其鑑定也需要把握時機。而目前哺乳動物中6mA的鑑定多集中HeLa，HEK293T和mES等有限的細胞系中，這可能導致無法真實反應6mA在哺乳動物中的豐度。因此，為更準確的了解哺乳動物中6mA的含量，還需擴大檢測範圍（如檢測各發育時期中6mA的豐度）。
2）單一位點的單個修飾也有大功能；
雖然有關6mA的豐度尚存爭議，但是高精度質譜檢測已提示6mA在哺乳動物中的含量非常有限，這也為6mA的生物學功能畫了問號，豐度低就說明沒有什麼大功能嗎啊？那麼，表觀遺傳修飾的豐度和生物學功能間是怎樣的關係呢？
今年5月，澳大利亞新南威爾斯大學的Merlin Crossley 教授在Nature Communication發文「Methylation of a CGATA element inhibits binding and regulation by GATA-1」【18】，該研究發現c-kit基因座位的單個5mC甲基化位點就足以影響轉錄因子GATA-1對該基因座位的結合，並調控造血系統的正常發育。這從某種程度上說明低豐度的表觀遺傳修飾也可通過影響某一生物過程的關鍵基因而發揮巨大作用。因此，為探索6mA的生物學功能，開發可信賴的6mA分布位點檢測方法是十分必要的。
六、關鍵論文作者的回應
6mA研究出現了很多的爭議和討論，Bioart聯繫上述研究中的多位相關人士了解他們對於該領域的看法，有永遠不信的、有將信將疑的、有絕對相信的，當然還有一直觀望看戲的。此外，BioArt特別邀請了兩位直接參與實驗的關鍵論文第一作者Tao P. Wu博士和Eric L. Greer博士，談談他們對6mA的鑑定和相關催化酶的看法。
Tao P. Wu博士（現在貝勒醫學院人類與分子遺傳系建立實驗室）早前在耶魯大學的Andrew Z. Xiao教授實驗室做博後，是6mA在小鼠胚胎幹細胞中的鑑定和發現ALKBH1是6mA去甲基化酶的研究的第一作者【6】，同時也是2018年Cell論文（6mA修飾與膠質瘤）的共同第一作者【8】。Tao P. Wu博士關於小鼠ESC中6mA含量低和受質譜中核酸酶的汙染等問題做出了回應：
「雖然越來越多的證據顯示m6dA是哺乳動物中一種功能性的DNA表觀修飾，但是仍然有來自陰性結果的質疑，需要進一步探討。在我們發表第一篇Nature文章之後，德國的Thomas Carell研究小組發文聲稱在wild-type mouse ES cell 中檢測不到m6dA (with UPLC-MS/MS)。讀者如果熟悉幹細胞研究相關背景的話，應該很清楚小鼠幹細胞的培養有多種條件與方法，其中尤其以培養基對細胞狀態的影響最大。Andrew Z. Xiao實驗室正在撰文，描述它們對DNA修飾的影響。最近，Eric Greer小組（postdoc in Yang Shi Lab before）又發表結果，聲稱DNA digestion enzyme含有來自細菌DNA 的汙染。
這在我們和其他幾個實驗室做UPLC-MS/MS檢測的時候，都沒有發現類似的結果；相關的對照實驗結果我們也會放在未來的文章當中。對於SMRT Sequencing,Shijia Zhu&Gang Fang在Genome Research文章中已經進行過討論（Nat Rev Genet發表房剛組細菌表觀組綜述論文），在m6dA豐度極低的情況下，SMRT 會產生假陽性結果。這也正是為什麼，該領域亟需新的方法和研究模型。最近，肖傳樂&Kai Wang發表文章，嘗試了利用機器學習算法分析Nanopore sequencing數據來讀取DNA修飾信息。Tao P. Wu實驗室也在開發新的方法，拓展新的研究模型。」
Eric L. Greer博士早前是施揚教授的博士後，鑑定了線蟲中的6mA【4】，並發現哺乳動物的6mA可能來源於核酸酶的汙染。Eric L. Greer博士目前在哈佛醫學院獨立開展研究工作，就目前鑑定的6mA相關催化酶的看法如下：（原文附在譯文之後）
「就哺乳動物6mA催化蛋白的酶活性而言，這些蛋白都是我們之前在線蟲中鑑定的6mA相關催化酶的同源蛋白。我們在體外條件下得到的酶活性不能真實反應生理條件下該酶的催化活性，但是實驗間的平行性差（當我們有關線蟲中6mA及相關催化蛋白的文章出來時，我們已鑑定了哺乳動物中6mA催化酶，只是這些結果太初步了）。這可能是由於我們未得到最佳的酶反應條件，也可能這些酶有其他的更主要的作用底物，而當過表達它們到過高的濃度時，它們也可以完成N6位的甲基化和去甲基化過程。如果這些酶最主要的底物是其他物質（比如RNA或者其他DNA修飾），當在某一體系中過表達超高濃度的你感興趣的蛋白，來迫使它們發揮功能時，你可能被結果所欺騙，認為找到了正確的底物。這就是為什麼進行酶活性動力學實驗非常重要，這有利於確認它們在生理條件下的活力。」
（以下為郵件原文：In terms of the enzymatic activity of the mammalian proteins these have all been identified as homologues of proteins that we identified in C. elegans. We have found that we get spurious activity of these proteins in vitro but it is not consistent from experiment to experiment
(we had actually identified the mammalian proteins at the same time when our C. elegans story came out but thought they were too preliminary). This could reflect that the enzymatic conditions are not optimal or that these enzymes have another primary substrate and when forced in excessive concentrations to methylate or demethylate N6 on adenosine they will.
If the primary target of the enzyme is something else (say RNA or another DNA modification) you can still force activity by overloading the system with really high concentrations of your enzyme of interest and trick yourself into thinking that it is the right target.
That is why it is important for showing methylases and demethylases to perform kinetic experiments to determine whether the enzymatic activity would be physiologically relevant.）
實際上，不僅是6mA相關催化酶，包括目前最受關注的RNA m6A修飾，其去甲基化酶FTO的身份也經歷了多次質疑和反轉。由此可以看出，甲基化酶和去甲基化酶可能同時存在多種催化底物，比如FTO可同時介導m6A和m6Am去甲基化，解析其生理條件下最主要的催化底物才是關鍵。
此外，BioArt編輯部也注意到在國家自然科學基金中，有235萬元的項目涉及6mA，包括6mA在植物和動物中的多項研究。鑑於6mA的爭議和其在線粒體穩態維持的功能，今後的研究需秉持更加嚴謹和科學的態度，為我們揭開高等生物中6mA的全貌。
編後記：對於爭議領域來說，正常的學術討論是非常有必要的，講究「有一份證據說一分話」，最好做到不打棍子，不扣帽子。新興領域出現爭議是再所難免的，面臨爭議就需要更多的研究同行攜手探求科學的本質，努力就本領域的問題達成共識，良性的學術討論環境才能促進領域紮實的向前發展。
BioArt特別提醒有興趣研究DNA 6mA生物學功能的實驗室，從事DNA 6mA有較高的門檻，目前除了高靈敏度的質譜技術（排除了可能汙染）以外，基於抗體、三代測序的技術都存在很大的不確定性，再者圍繞6mA修飾的相關酶類也存在極大的爭議，因此，圍繞6mA開展生物學功能研究的時候都需要採取審慎的態度，切勿盲目跟風下結論。
圍繞6mA修飾的討論還會持續下去，就這個話題BioArt也非常歡迎相關專家來稿發表不同的觀點和意見。上述文章也並未對每一篇相關文章都進行了展開，限於學識和水平，文中錯誤疏漏之處在所難免，還請讀者包容！
編者特別感謝一年多來，何川（芝加哥大學）、施揚（哈佛醫學院）、陳大華（中科院動物所）、李海濤（清華大學）、伊成器（北京大學）、楊運桂（中科院基因組所）、汪海林（中科院生態環境研究中心）、房剛（美國西奈山醫學院）、藍斐（復旦大學）、吳濤（貝勒醫學院）、謝琦（西湖大學）、劉穎（北京大學）、駱觀正（中山大學）、陸發隆（中科院遺傳發育所）、沈立（浙江大學）、Eric L. Greer（哈佛醫學院）等多位專家就DNA 6mA修飾相關研究坦誠地提供相關信息和個人觀點，部分專家審閱全文並提出了寶貴意見。