原標題:一篇NC文章告訴你circRNA研究新思路
一般circRNA的研究思路主要是ceRNA,即circRNA可以結合miRNA,使miRNA的靶基因上調;或者ceRNA可以降低其來源mRNA的翻譯水平。但是今天分享的這篇NC文章提供了新思路!circRNA可以結合蛋白,阻止蛋白行使功能,產生生物學效應。
摘要
環狀RNA在真核細胞中是廣泛表達的,但是其於人類疾病的關係還不清楚。這裡我們發現環狀RNA circANRIL(circular antisense non-coding RNA in the INK4 locus)可以通過抑制rRNA的成熟,促進細胞的凋亡,抑制增殖,激活p53通路,達到防止動脈粥樣硬化的作用。circANRIL來源於和動脈粥樣硬化相關的基因位點,可以與rRNA前體競爭結合PES1蛋白,從而是rRNA前體在細胞內聚集,細胞和壓力增加,引起核仁的碎裂,p53的激活,細胞凋亡,不會在動脈中形成斑塊。
文章思路
發現circANRIL在不同程度的動脈粥樣硬化的斑塊內表達不同,與病重程度呈負相關。
circANRIL沒有ceRNA的作用,也沒有cis作用。過表達circANRIL,發現可以結合在circANRIL的三個miRNA沒有變化,其來源的lncRNA也沒有變化,其位點附近的mRNA同樣沒有變化。
過表達circANRIL可以抑制平滑肌細胞和單核巨噬細胞的增殖,促進凋亡。
由於circANRIL來源的lnc有結合蛋白的作用,所以作者用label-free檢測了與circANRIL結合的蛋白譜。這個實驗類似於chip-seq,作者先在circANRIL上加上BoxB的核酸序列,這個序列會與-N-peptide結合,然後再用抗體pull-down ,用label-free檢測蛋白譜。富集分析發現circANRIL pull-down下來的蛋白主要在核糖體RNA的形成和RNA剪切上。然後作者重顯著富積的蛋白中選擇了幾個與核糖體剪切相關的蛋白,做RIP驗證,發現circANRIL可以顯著結合PES1蛋白。
circANRIL和rRNA雖然不屬於同一個RNA家族,但是有多個同源序列,且軟體預測circANRIL與PES1的結合區域正是位於同源序列內,且PES1的結合區域就是其行使剪切rRNA前體的功能區域。
驗證過表達circANRIL,引起的rRNA前體的聚集和p53的激活,核仁的碎裂,細胞的凋亡;將PES1中與circANRIL結合的區域敲出,同樣可以引起上述現象;但是在過表達circANRIL的細胞中補充PES1後可以抑制上述現象。
可借鑑之處
1. circRNA的過表達,在序列兩端加上內含子的序列,有助於circRNA的形成。
2. circRNA的幹擾,幹擾circRNA的同時,也就幹擾了其來源的基因;解決辦法就是通過在幹擾後的細胞中過表達circRNA,看性狀是否消失。
3. 怎麼預測circRNA是否可以與某個蛋白結合,其結合的區域是什麼。文章中使用的是catRNPID的軟體,有在線版的,使用方法見分割線以下的部分。
catRNPID在線軟體的使用方法:
1. 打開網頁http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group
如果打不開的話,就換用谷歌或火狐瀏覽器。會用到其中的兩個工具:
2. 評估蛋白是否可以結合RNA,結合的區域是哪些
進入「catRAPID signature」,把蛋白序列粘貼入方框中,填寫郵箱,點提交就可以了。蛋白的個數不能超過100個,總胺基酸不超過10萬個。
蛋白序列的格式,像下面這樣:
>Unigene0000024
QEEEGLTGSSPSVENGVSEVLANRCDFKPVGSSELEEDEGFSDWSLKLEQRKQRSSGAQE
AEA
>Unigene0000025
MNHLEVAQEVEVSDEPGNGQVNESVEADLEHFEVEEEQQQQYALPYSRQGRGDREGQPGH
EDEG
>Unigene0000034
IKEEARRMIRNAQQVVALVMDIFTDVDLFSDLLDVAARRVPVYILLDDLNKQHFLDMAAK
CRVNLNYAEFLRVRTVSGPTYFCRTGMSFKGQLMEKFMLVDCNVVLSGNYSFMWSFEKIH
RSIAHIFQGELVASFDEEFRILFAQSEPLIPSETALIKMDNPFVMAPYSGTRPFYQRKLH
MMFPRDDSSMNSLPAYAD
過一陣時間(每個蛋白3分鐘算),會把結果發郵箱中,告訴你每個蛋白的得分(0.5分之下,認為不具備結合RNA的能力),可能的RNA結合區域(有的得分超過0.5,但是不一定可以預測到RNA結合區域),如下:
3. 預測蛋白與某RNA的結合情況
進入「catRAPID fragments」,輸入蛋白序列和RNA序列(格式同上),填郵箱提交。
後面會受到郵箱,點開結果連結就可以看到結果了,得到如下圖的熱圖和表格。熱圖是png格式的,但是我們可以根據下面的表格畫成pdf格式的熱圖。
嗯的,今天的分享就到這裡啦~
來源:基迪奧生物返回搜狐,查看更多
責任編輯: