整合多種基因組技術調查耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌的爆發

2021-01-13 美格基因

本周帶來Nature communication上的一篇佳作，研究通過整合多種基因組技術調查，耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌爆發的源頭，跟著圖文一起鑑賞佳作吧！

Integrating multiple genomic technologies to investigate an outbreak of carbapenemase-producing Enterobacter hormaechei

整合多種基因組技術調查耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌的爆發

作者：Leah W. Roberts 等

期刊：Nature communication

時間：2020

影響因子：12.353

DOI:10.1038/s41467-019-14139-5

研究背景

耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌（CRE）是讓人聞之色變的超級細菌，對人類的健康有很大的威脅。2015年作者對皇家布裡斯班婦女醫院（RBWH）三位病人不同階段的尿液、氣管內導管、血液、傷口進行取樣，並從中發現了具有多重抗藥性（MDR）的E.cloacae複合分離株。作者通過幾種互補全基因組測序(WGS)技術的應用，確認了在醫院爆發的是耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌E.hormaechei。

實驗結果

1. 所有患者均檢出耐碳青黴烯類腸桿菌科細菌

對所有採集到的E.cloacae複合分離株進行耐藥性檢測，結果顯示，MS7889對碳青黴烯類抗生素完全敏感，除了MS7889(從患者尿液中分離出來)外，其餘菌株對頭孢曲松、頭孢他啶、羥基噻吩青黴素-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大黴素和甲氧苄啶-磺胺新唑均有耐藥性（表1）。

表1 用Etest、Vitek 2和ResFinder測定抗生素耐藥性

2. 全基因組測序確認菌株爆發可能與之前產生IMP4的分離株有關

對獲得的10個E.cloacae複合分離株使用Illumina進行全基因組測序。發現其均為ST90型E.hormaechei，除易感菌株MS7889丟失了blaIMP-4基因以及幾個額外的抗性基因，其它大多數複合分離株都有相同的抗性基因，包括100%相同的blaIMP-4基因。10個分離株中均包含lncHI2質粒。將E.hormaechei基因組與公開可用的基因組進行比較，發現其與E.hormaechei Ecl1(GenBank: JRFQ01000000; formerlyE. cloacae)最為匹配，E.hormaechei Ecl1是一株從RBWH ICU病房的燒傷患者身上分離出來的ST90菌株。

大多數複合分離株與Ecl1基因組的抗生素耐藥基因圖譜相比，顯示了相同的耐藥基因圖譜（表1）。在醫院範圍內對自2015年呈blaIMP-4陽性的E. hormaechei分離株進行持續監測，發現在2016年一次不相關的疫情中，分離出一個blaIMP-4陽性的E. hormaechei(MS14389)，根據Illumina測序發現，與2015年分離的菌株相比，只有兩個SNPs不同。2017年，又從血液學病房分離出另一例blaIMP-4陽性的E. hormaechei (MS14449)。這些結果表明E. hormaechei 在醫院環境中持續存在。

3. blaIMP-4基因存在於lncH12質粒上

由於blaIMP-4基因周圍存在多個重複元件，包括插入序列(IS)和兩個可疑的基因內容相似的整合子，無法僅靠Illumina測序準確解析blaIMP-4的上下遊序列。於是對其中的一個代表分離株（MS7884）使用PacBio SMRT進行三代測序，獲得了完整閉合的染色體和兩個質粒（pMS7884A，一個在~55kb MDR區含有blaIMP-4基因的330,060bp的lncHI2質粒）。pMS7884A MDR區域具有兩個不同的1類整合子(In37和In809)以及一個對四環素和氯黴素具有抗性的複合轉座子（圖1a）。BLASTn和read-mapping分析顯示，本研究中，利用Illumina測序的18株分離株中，除了分離株MS7889，其餘的都有相同的質粒：分離株MS7889預計已經失去了MDR質粒的~ 34 kb區域，包括blaIMP-4,基因和兩個因為同源重組而幾乎一樣的氨基糖苷類抗性基因（圖1 b）。

圖1 含有~55kb多藥耐藥性區域包括blaIMP-4的大lncHI2質粒

4. 全基因組測序揭示了爆發的來源來源於地漏

儘管持續使用傳統培養方法對醫院環境進行常規監測，但未發現ST90 E. hormaechei的環境來源。2018年7月，從ICU和燒傷病房環境中收集了50個拭子和水樣，並對其進行測序和傳統培養。在本次監測中，通過傳統培養方法在4份樣品中檢測到Klebsiella oxytoca, E.cloacae complex和Leclercia adecarboxylata，然而，Illumina測序結果表明它們與爆發無關。儘管沒有親緣關係，但其中3個分離株攜帶blaIMP-4相似基因(基於real-time PCR)，該基因對應的IncHI2質粒與pMS7884A高度一致。

儘管傳統的培養方法無法檢測到ST90 E.hormaechei，宏基因組測序鑑定出兩個樣本與參考MS7884和IncHI2質粒pMS7884A的 ST90 E. hormaechei高度匹配。將這些樣本（R5514 and R5537，均取自於地漏）的宏基因組組裝基因組（MAGs）與E. hormaechei參考基因組作核苷酸比較，顯示在整個染色體和質粒上有著很高的相似度，相當於>95%的參考序列中93-97%的平均核苷酸同一性(ANI)。兩種MAGs的MLST分析也能夠檢測到幾乎相同的ST90等位基因。此外，通過對抗性基因的篩選，在兩份樣本中都發現了blaIMP-4基因，進一步支持了地漏中存在ST90 E. hormaechei 和類似於pMS7884A的IncHI2質粒。

結論與亮點

1.通過Illumina測序發現爆發菌株序列均為90型（ST90）；

2.通過三代測序（PacBio SMRT）獲得了IMP-4的菌株的lncH12質粒上的blaIMP-4基因的完整基因組；

3.通過宏基因組學測序在醫院地漏中發現了ST90型E.hormaechei lncH12存在的證據；

4.總體而言，作者利用幾種不同WGS技術的戰略應用為疫情提供了深入分析。

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