cell death&disease:大腸癌細胞壞死性藥物療法

2021-01-20 生物谷

2015年5月4日 訊 /生物谷BIOON/ --大腸癌（Colorectal cancer）是致死率很高的主要癌症類型之一。目前用於治療大腸癌的方法主要是藥物治療，比如5-FU，以及irinotecan。然而，臨床上接受藥物治療的晚期大腸癌患者五年存活率不足10%。常規性的抗癌藥物的主要作用機理是引起DNA的損傷以及細胞的死亡，包括線粒體介導的內源性細胞凋亡以及死亡受體介導的外源性細胞凋亡。在腫瘤惡化過程中，新產生的腫瘤細胞經常會發生遺傳或表觀遺傳上的突變，導致其對細胞凋亡不再敏感。因此，尋找其它導致癌細胞死亡的方式對於癌症的治療十分重要。

很久以來，細胞壞死都被認為是一類無規律的、被動性的細胞死亡方式，主要由炎症反應與組織損傷引發。最近幾年的研究發現一些類型的壞死也是受到信號調控的。主要機理是：TNF-R1受到TNF-a的刺激激活，從而招募下遊的絲氨酸激酶-RIP1與RIP3，進一步促發細胞壞死。在正常狀態下這種程序化細胞壞死信號被細胞凋亡所抑制。在小鼠中，當caspase 8缺失後，小鼠由於RIP3導致的細胞壞死信號活化使得其在胚胎期致死。當額外敲除RIP-3後，小鼠便可正常發育。另外，在體外實驗中caspase-8的抑制能夠將TNF-a引導的細胞凋亡向細胞壞死方向轉變，這一過程依賴RIP1, RIP3以及下遊的效應分子MLKL。然而，目前對於DNA損傷如何引發細胞凋亡的機制仍不清楚。

 

最近，來自美國匹斯堡大學醫學院的MF Brown等人在《nature cell death&disease》雜誌發表了癌細胞壞死引發機制的研究結果。

 

首先，作者以人大腸癌細胞系HCT116為研究對象，人為敲除了細胞中的caspase 3蛋白。出人意料的是：敲除後的細胞系HCT116-/-對5-FU等癌症藥物處理變得異常敏感（細胞生長受阻，細胞凋亡增多）。通過將腫瘤移植入小鼠體內，作者發現caspase 3敲除後的，在小鼠體內腫瘤耐藥性相對於野生型（HCT116WT）下降明顯。

 

之後，作者通過生化檢測的手段發現HCT116-/-細胞與HCT116WT細胞在5-FU刺激下均發生了明顯的caspase 9與caspase 7的切割活化。這一結果說明DNA損傷引起的細胞凋亡並沒有收到影響。此外， HCT116-/-細胞在受到刺激後還出現了非細胞凋亡的現象：HMGB1的釋放。對於細胞凋亡進行染色分析，作者發現HCT116-/-細胞與HCT116WT細胞在5-FU刺激下均發生了一定比例的細胞凋亡（Annexin-5+）,而且這一亞群可以被pan-caspase 抑制劑Z-VAD完全抑制。然而，HCT116-/-細胞還有相當一部分細胞亞群是壞死狀態（Annexin-5-/PI+），這在野生型細胞中並沒有出現，而且這一部分細胞不能被Z-VAD所抑制。

 

之前的研究發現，細胞壞死的信號是由一個經典的蛋白複合體介導的。這一複合體由caspase-8，RIP1，RIP3組成，可以被稱為"壞死小體"。通過免疫共沉澱實驗，作者發現在HCT116-/-細胞與HCT116WT細胞中，5-FU的刺激能夠促進這一小體的形成，而在HCT116WT細胞中caspase 3也存在於這一複合體中。通過Z-VAD進行阻斷，作者發現HCT116WT細胞的caspase 3不再存在於這一小體中，而展現出於與HCT116-/-細胞相似的表型。之後，作者向HCT116-/-細胞轉入無酶活性的caspase-3，檢測發現這一處理能夠完全抑制HMGB1的釋放與壞死的發生，這一結果說明caspase-3抑制壞死小體的發生不依賴於其酶活性。

 

之後，作者希望了解5-FU誘導的HCT116-/-細胞的壞死是否依賴caspase-8或RIP1，因此作者利用不同的手段（shRNA，dominant negative mutant，小分子抑制劑，siRNA）抑制RIP1與caspase-8的活性。檢測結果發現，這些抑制的處理均能阻斷5-FU刺激HCT116-/-細胞後引發的細胞壞死（Annexin-5/PI染色）與HGMB1的釋放。之後，作者針對另外一株細胞系RKO利用shRNA方法進行caspase-3的敲低。結果與上述相同。

 

最終，作者證明了這一信號依賴於下遊的活性氧反應。

 

總之，該文章第一次提出了caspase-3對於癌細胞的壞死具有負向的調控作用，因此在臨床上結合DNA損傷藥物與caspase-3抑制劑藥物進行配合治療有望誘導癌細胞發生壞死，從而達到最終清除癌細胞的目的。（生物谷Bioon.com）

 

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PMC:

 

PMID：

 

Loss of Caspase-3 sensitizes colon cancer cells to genotoxic stress via RIP1-dependent necrosis

 

M F Brown, B J Leibowitz, D Chen, K He, F Zou, R W Sobol, D Beer-Stolz, L Zhang and J Yu

 

Caspase-3 is the best known executioner caspase in apoptosis. We generated caspase-3 knockout (C3KO) and knockdown human colorectal cancer cells, and found that they are unexpectedly sensitized to DNA-damaging agents including 5-fluorouracil (5-FU), etoposide, and camptothecin. C3KO xenograft tumors also displayed enhanced therapeutic response and cell death to 5-FU. C3KO cells showed intact apoptosis and activation of caspase-7 and -9, impaired processing of caspase-8, and induction of necrosis in response to DNA-damaging agents. This form of necrosis is associated with HMGB1 release and ROS production, and suppressed by genetic or pharmacological inhibition of RIP1, MLKL1, or caspase-8, but not inhibitors of pan-caspases or RIP3. 5-FU treatment led to the formation of a z-VAD-resistant pro-caspase-8/RIP1/FADD complex, which was strongly stabilized by caspase-3 KO. These data demonstrate a key role of caspase-3 in caspase-8 processing and suppression of DNA damage-induced necrosis, and provide a potentially novel way to chemosensitize cancer cells.

 

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