撰文 | 鹹姐
癌症是一種多階段的遺傳和表觀遺傳疾病，病因複雜，涉及癌基因和抑癌基因的突變、下調、過表達和缺失等多方面【1】。癌症基因組學的發展已經確認了數千個可能的癌症驅動基因（driver gene），這些基因的突變可以促進腫瘤的發生。一個典型的腫瘤包含2到8個這樣的「驅動基因」突變，剩下的突變則是不提供選擇性生長優勢的「乘客」，驅動基因調節著腫瘤的細胞命運、細胞存活和基因組維持等重要的細胞過程【2】，更好地理解這些基因發揮作用的機制是基礎癌症研究中最緊迫的需求之一。
現有的用於研究癌症生物學特性的體內和體外模型都被時間證明是有效的，但是每種模型又有其局限性，例如基因工程小鼠模型雖然考慮到了腫瘤生長及其微環境，但是受到可量化性、時間和成本的限制【3】；基於異種移植的模型則在規模上受到限制，而且在體外很難操作；體外二維單層細胞培養（2D細胞培養）常用於對腫瘤生長和藥物敏感性等的基因組水平的研究，但其缺乏疾病的很多特徵，包括缺氧【4】、細胞相互接觸改變【5】和代謝重編程【6】等，而體外類器官模型（即3D細胞培養）可以緩解這些擔憂，但是其可量化性存在缺陷。如何選擇癌症研究的模型成為不可忽視的問題，開發高通量和精確的模型來研究驅動基因的功能是目前一個主要的挑戰。
近日，來自美國史丹福大學醫學院的Michael C. Bassik教授團隊的一項研究就為我們在選擇癌症研究模型時提供了一些警示與啟示，這項研究在線發表於Nature雜誌，題為「CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities」。該研究設計了一個可量化的3D肺癌模型，並通過全基因組CRISPR篩選發現2D肺癌細胞培養與3D肺癌模型之間存在的基因差異，尤其是突變基因的差異巨大，指出3D模型可以更準確的再現體內腫瘤的表型，從而建立了一套在3D球狀癌症模型中執行CRISPR篩選以揭示癌症特性的通用策略。
目前在2D單層細胞培養中進行的CRISPR篩選已經產生了大量的信息，但是卻往往不能複製腫瘤生物學的關鍵方面，因此，本文的研究人員首先利用肺腺癌細胞系H23（存在KRASG12C突變），通過優化接種密度和甲基纖維素濃度，開發了一個可量化的3D肺癌球狀模型；然後利用全基因組CRISPR結合KRASG12C抑制劑ARS-853分別對2D培養和3D培養的肺癌細胞進行篩選（圖1）。分析結果顯示，全基因組CRISPR篩選下，3D培養細胞更多地呈現生長加快的表型，而2D培養的細胞則大多表現為生長抑制。同時，致癌基因和腫瘤抑制因子的表型在2D培養的細胞中均表現為生長抑制；但在3D培養的細胞中的表現差異明顯，腫瘤抑制因子的敲除使得細胞生長變快。
此外，通路富集分析也在兩者間出現明顯差別，3D培養細胞以癌症特異性通路（如p53和Ras通路）富集為主，而2D培養細胞富集的通路則普遍涉及重要細胞功能，如DNA複製。由此表明3D培養能更準確地獲得癌症相關基因及通路的特徵。進一步地分析發現，這些在2D和3D培養條件下具有敏感性差異的基因大部分富集在肺癌突變基因中，由此也提示利用3D癌症模型對具有不同效應的基因進行分析，將有可能增強識別癌症驅動基因的能力。
圖1 H23細胞中CRISPR篩選流程圖
與此同時，若將3D培養細胞的表型與相對應的2D培養細胞的表型進行標準化（3D/2D），上述這些效應將變得更加明顯。究其原因可能有二個：第一，利用2D培養細胞的表型將3D培養細胞的表型進行標準化，可以最小化對兩者細胞生長都至關重要的核心必需基因在其他方面的主導作用，從而更好地揭示腫瘤特異性基因；第二，如之前研究所假設的，3D球狀培養可能可以更好地模擬體內腫瘤。而本文進一步的實驗分析也表明，來自3D培養細胞篩選出的基因表型與小鼠異種移植模型的基因表型的相關性，明顯高於其與來自2D培養細胞中篩選出的基因表型的相關性。當然，比較其他肺癌細胞系的不同培養模型也能得出類似的結果。
既然具有很強的3D/2D表型的基因會因肺癌突變而富集，那麼是否可以從中找到新的治療靶點呢？答案是肯定的。在2D培養模型中不存在差異，但是在3D培養模型中存在明顯表型的基因——羧肽酶D（CPD）（圖2），是金屬羧酸肽酶家族中特徵相對不明顯的一員，它能從多肽中裂解C末端精氨酸和賴氨酸。實驗表明，CPD的表達與肺癌患者的預後相關，而CPD的缺失可以有效地抑制腫瘤的生長，並且其缺失表現出與KRASG12C抑制劑ARS-853明顯的聯合致死效果，尤其是在3D培養中。進一步實驗證實，CPD的這種作用是通過調節胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）實現的，它可以從IGF1R的α鏈上去除對其受體活性至關重要的C-末端RKRR基序，從而影響IGF1R的成熟與功能。由此也表明IGF1R的表達和/或依賴性以及KRAS的突變可能作為肺癌靶向CPD和KRASG12C聯合治療的生物標誌物。
圖2不同培養模型中引起表型的基因
綜上所述，能夠系統地、大規模地確定腫瘤為響應獨特的環境而生長和生存所必需的基因，將有助於改進藥物靶點識別模型以及更好地了解癌症的生長。而本文很好地展示了一種在3D球體細胞培養中進行的基因組級別的CRISPR篩選的強大策略，揭示了與2D單層細胞培養相比，3D培養中細胞的表型更接近癌基因和腫瘤抑制因子的預期結果，並且與腫瘤異種抑制中的表型更一致。同時，通過CPD基因的功能研究告訴我們，精確的腫瘤功能缺失表型的體外模型可能對治療策略的個性化很重要，選對研究模型將是腫瘤研究的第一步。
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2099-x
製版人：Kira
參考文獻
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5. Loessner, D.et al. Bioengineered 3D platform to explore cell–ECM interactions and drugresistance of epithelial ovarian cancer cells.Biomaterials31, 8494–8506(2010).
6. Dang, C. V.& Semenza, G. L. Oncogenic alterations of metabolism.Trends Biochem. Sci.24, 68–72 (1999).
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