有機相中DNA和蛋白質的分離,通過按順序用乙醇、異丙醇進行沉澱

2020-12-01 歷史纏

不要使DNA沉澱完全乾燥，否則DNA極難溶解。本方案(Chomczynski 1993)可以從部分組織或細胞中同時提取的RNA、DNA和蛋白質。

像它的前身(Chomczynski and Sacchi 1987) -樣，此方法涉及用異硫氰酸胍和苯酚的單相溶液裂解細胞。加入氯仿產生第二(有機)相，從而DNA和蛋白質被抽提，而RNA留在水相上清中。

有機相中DNA和蛋白質的分離，通過按順序用乙醇、異丙醇進行沉澱。

從有機相中回收的DNA是20kb大小、適合進行PCR反應的模板。蛋白質由於暴露在胍中，而變性則主要用於免疫反應。

用異丙醇從水相中沉澱出的RNA可通過色譜法在寡核苷酸-纖維素柱進-步純化和/或用於Norther雜交、反轉錄或RT-PCR總RNA的產率因組織或細胞來源而異，但一般而言， 組織的初始產量為4~ 7ug/mg，細胞為5~ 10 mg/107個細胞，所提取的RNA的A26/A280比值為1.8~ 2.0。

準備細胞或組織樣品提取RNA。對於組織樣品處理含有豐富的蛋白質分解酵素的組織如胰腺或腸道時，最好將組織先切成小塊(100mg)，然後直接放入液氮中。

快速冷凍的組織可以被轉移到-70°C保存或立即用於提取RNA (如下文所述)。組織可以存儲於-70C數月而不影響RNA的產量或完整性。

冷凍和粉碎並不是必需的。不含有豐富的RNase的組織可以被迅速剁碎成小塊，

並直接轉入加有適量溶液D (步驟1.ii)的聚丙烯snap-cap管中。

相關焦點

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  • 異丙醇簡介
    鹽析法 可以採用普通精餾與加鹽分相技術回收異丙醇，採用加鹽分相法處理時，當60.0%氟化鉀濃溶液與50％異丙醇－50％水的物料的質量比為2.0時，有機相中異丙醇的純度可達95.62%（質量百分數），水相中氟化鉀稀溶液經蒸發回收後循環使用不影響分離性能。採用以上技術從製藥廢液中回收異丙醇。
  • 細菌DNA提取方法的優化
    水稻白葉枯病菌作為實驗菌株，將培養一定時間的菌種所提取的dna，在紫外分光光度計下進行測定。，離心8 min後吸取上清至新的離心管內； 步驟七：加2倍體積無水乙醇沉澱dna後離心8 min，用70％乙醇洗滌沉澱2次。