行業|震驚!CRISPR新冠檢測技術竟然和早孕檢測差不多?

前言

新冠疫情爆發以來，如何快速高效檢測出新冠病毒成了全球關注的焦點。雖然基於血清學的檢測快速且僅需要少量的設備，但由於患者可能在症狀發作之後的數天甚至數周才會產生可檢測的抗體，所以其實用性有限。而目前全球大量科研團隊都在研究和開發基於CRISPR-Cas9的新冠病毒檢測技術，竟然和早孕測試差不多？   

一、CRISPR技術簡介 

CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦機制，可用來對抗入侵的病毒降解外源 DNA。該系統由 Cas9核酸酶和確定靶向序列的RNA複合體組成，後者由 crRNA和反式激活 RNA(tracrRNA) 組成。   

二、CRISPR技術的應用 

在 實 際 應 用 中，crRNA 和 TracrRNA 可以融合成為一條 RNA( sgRNA) 發揮功能。簡化後的 CRISPR/Cas9 系統由兩部分組成: Cas9 蛋白和 sgRNA。CRISPR/Cas9 系統的發展徹底改變了人們編輯 DNA 序列和調控目標基因表達水平的能力，從而為生物體的精確基因組編輯提供了有力的工具。該系統作用原理為 sgRNA 通過自身的 Cas9 把手與 Cas9 蛋白形成 Cas9-sgRNA 複合體，Cas9-sgRNA 複合體中 sgRNA 的鹼基互補配對區序列與目標基因的靶序列通過鹼基互補配對原則進行配對結合，Cas9 利用自身的核酸內切酶活性對目標 DNA 序列進行切割。 與傳統的基因組編輯技術相比，CRISPR/Cas9 系統具有幾大明顯的優勢：成本低廉、構建簡單、操作方便、覆蓋大多數區域。該技術也常用於基因敲除、基因替換、基因激活、基因治療、疾病模型構建等方面。 

三、在研基於CRISPER技術的SARS-CoV-2檢測技術 

目前在研的基於CRISPR-Cas9技術的SARS-CoV-2檢測項目如下圖所示。分別是HERLOCK Bioscience開發的SHERLOCK技術，Mammoth Biosciences開發的DETECTR技術，康涅尼格大學研究人員開發的AIOD技術，加州大學聖芭芭拉分校研究人員開發的CREST技術印度CSIR基因及整合生物學研究所研究人員開發的FELUDA技術。

     

1、SHERLOCK SHERLOCK是由Sherlock Biosciences和MIT聯合開發的一項新冠檢測技術，Sherlock Biosciences是2019年3月創立的一家生物技術公司，該公司由張鋒等9位在CRISPR技術領域和癌症、傳染疾病診斷技術領域的專家共同創立，核心技術由麻省理工學院和哈佛大學授權，分別是基於基因編輯技術CRISPR的診斷技術平臺SHERLOCK，和基於合成生物學的分子診斷平臺INSPECTR。   2020年2月，張鋒教授和他的合作夥伴宣布開發出一項基於CRISPR的新冠病毒檢測技術，不需要複雜的設備，三步檢測僅需約1個小時，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結合的嚮導RNA。根據新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設計了能夠靶向新冠病毒特異性序列的嚮導RNA。 理論上講，只要樣本裡有新冠病毒所對應的RNA，嚮導RNA就能對其進行精準的識別，並激活與其結合的Cas13a蛋白酶。Cas13a一旦被激活，它就會切開所遇到的任何RNA分子。也正是利用這種特性，研究人員們在樣本裡還會添加一種通過RNA相連接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會被切斷。這樣一來，通過確認這些分子有沒有被切斷，我們就能知道最初的樣本裡有沒有新冠病毒的存在。 

後續的檢測步驟與市場上的懷孕檢測很相似，將反應後的樣本滴在能夠識別「完整分子」和「切斷分子」的試紙上，如果樣本裡不存在新冠病毒，那麼試紙標識「完整分子」的較低位置上，就會出現一條條帶。相反，如果樣本裡真的有新冠病毒對應的RNA，那麼在代表「切斷分子」的較高位置上，會出現另一條條帶。通過條帶位置的不同，我們很容易就能確認新冠病毒的存在與否。   

該團隊在2020年5月發布了一個更新的檢測方法：一步 STOPCovid，這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術更進一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，並且將檢測新冠病毒所需的化學反應步驟在一個試管中完成。在檢驗12個新冠病毒陽性和5個新冠病毒陰性樣本的實驗中，這一檢測達到100%的特異性和97%的靈敏度。不過科學家們也強調，這一檢測方法還沒有獲得FDA的批准，尚不能用於臨床上對新冠病毒感染的診斷。一步 STOPCovid 試驗示意圖：

       

該團隊還進一步設計了可用於讀取 STOPCovid 試驗結果的設備盒：取樣至反應管，將密封的反應管置於檢測盒，用戶關閉檢測盒並拉動手柄，樣本在側向層析條上發生反應進行檢測，應用手機APP獲取條帶定量強度和相應測試結果。

 

該方法的優點在於：在 crRNA/靶基因複合體中存在兩個或多個錯配的情況下，Cas13a 不具有催化活性，所以對於高度相似的病毒不會給出陽性結果。與DETECTR所使用的 Cas12a 不同，Cas13a 對靶位點沒有嚴格的序列偏好，而 Cas12a 需要 PAM進行靶標切割，限制了使用範圍。2020 年 5 月 7 日，Sherlock Biosciences宣布其已獲得美國食品藥品監督管理局 (FDA) 對其 Sherlock™CRISPR新冠病毒試劑盒的緊急使用授權 (EUA)，該試劑盒用於檢測引起 COVID-19 的病毒，在大約一小時內提供結果。   

2、 DETECTR 新冠病毒 

DETECTR是由Mammoth Biosciences和UCSF聯合開發的一項新冠檢測技術，Mammoth Biosciences是一家美國生物技術公司，它由CRISPR大神Jennifer Doudna創辦，該公司的目標是使其CRISPR驅動的搜尋引擎成為疾病檢測的首選平臺。2020年四月，根據發表在《自然-生物技術》的一篇研究論文顯示，Mammoth Biosciences和加州大學舊金山分校（UCSF）的科研團隊合作開發出一種基於CRISPR技術的診斷工具，可以快速檢測出患者體內是否有新冠病毒。論文指出，使用這一技術大約只需45分鐘就能給出結果，相比之下，目前基於PCR的核酸檢測需要幾小時甚至幾天才能出結果，因此新技術可以大大縮短診斷時間。其檢測步驟和原理如下圖所示：

   

在檢測的 83 份已知 COVID 陽性樣本中，DETECTR 的陽性預測率為 95%，陰性預測率為 100%。它也是迄今檢測速度最快的測方法。此法需要進行RNA的提取，Lucia等研究人員對類似的方法進行了優化，可直接使用唾液檢測新冠病毒病毒，無需進行 RNA 提取，但僅當唾液中病毒載量足夠高（105 拷貝/μl）時才可能起作用。Mammoth Biosciences日前表示正在與GSK Consumer Healthcare合作，一起將其基於CRISPR的DETECTR平臺設計和製造成一次性家庭測試套件，該套件製造計劃在2020年底前完成。並在今年年底之前將向美國FDA遞交緊急使用授權（EUA）的申請。   3、AIOD 該技術是由康涅尼格大學生物醫學工程系的Changchun Liu教授團隊發明。其檢測步驟和原理如下：

 

該方法與 SHERLOCK 診斷檢測高度相似，在步驟的順序和使用的 Cas 蛋白方面存在差異。該方法的優點在於檢測時反應所需的所有組分混合放置於同一反應體系中，並在單一溫度下孵育。本檢測方法中設計了兩個 Cas12a-crRNA 複合物，使用兩個與兩個區域結合的 crRNAs 提高了檢測的靈敏度。且該反應不受 Cas12a 的前間隔區相鄰基序 (PAM) 的限制。該體系具有接近單分子水平的敏感性。以 HIV-1 和新冠病毒檢測為例，未經預擴增的 AIOD檢測體系能夠在 40 min 的孵育中檢測低至 1.2 拷貝的 DNA 靶標和 4.6 拷貝的 RNA 靶標。 

4、CREST  該技術是由加州大學聖芭芭拉分校分子細胞生物學系的Max Wilson，Diego Acosta-Alvear, Carolina Arias教授團隊共同發明。其檢測步驟和原理如下：

          

該技術使用PCR擴增逆轉錄 RNA 樣本，本檢測方法沒有使用典型的 PCR 儀，而是使用以電池供電通過藍牙即可以啟用的簡易PCR 儀。   5、 FELUDA  該技術是由印度CSIR基因及整合生物學研究所的Souvik Maiti 和Debojyoti Chakraborty研究員共同開發。FELUDA是一種基於FnCas9 的CRISPR技術，FnCas9 是一種對 DNA 內是否存在錯配以及這些錯配的位置高度敏感的蛋白。當存在兩個及以上的鹼基錯配時， FnCas9 將不會對靶基因序列進行切割。其檢測步驟和原理如下：  

      

該方法依賴於其對目標區域的活性，FnCas9 可在 10-50 ℃ 之間變化的溫度範圍內進行切割。   

6、五種檢測方法比較：

       

結語 

在以往的大流行病中，缺乏快速、便捷和準確的診斷測試技術，是阻礙公共衛生部門應對和控制新出現的病毒威脅的主要原因之一。如何開發具有經濟實惠，快速便捷特性的診斷工具，成為我們應對當下正在流行的COVID-19和未來可能突發的公共衛生事件的決勝步驟。基於CRISPR的診斷工具由於其具有準確便捷迅速的特點，可以在幾天內進行重新配置以檢測目標病毒。針對這一技術開發的診斷方法很有可能會改變以前流行病學檢測的方法。 

- END - 

作者 李飄飄

編輯 楊柳榮

排版 Elsa