淺談影響數碼顯微鏡解析度的兩大因素

2020-11-27 儀器信息網

數碼顯微鏡是在傳統顯微鏡上增加了數字圖像傳感器CCD或CMOS的顯微鏡，與計算機、圖像處理、自動化、網際網路等技術相結合，可衍生出多種產品和應用，如自動顯微鏡、數碼互動顯微鏡、數字切片掃描儀等，能給用戶帶來極大的便利，在教學、醫療、科研等領域得到廣泛的應用。

作為傳感器，人眼和數字圖像傳感器CCD/CMOS主要有兩方面的不同：一是數字圖像傳感器是由很多離散的感光器件組成，用其作為傳感器接收顯微圖像，實際上是一個數位化過程（也稱為空間採樣）需要滿足採樣定理即奈奎斯特定理，這樣圖像才能準確重建；二是數字圖像傳感器的響應波長與人眼不一樣，所以會受光源光譜特性的影響。本文從空間採樣率和光源這兩方面來分析對數碼顯微圖像解析度的影響。

空間採樣率對數碼顯微圖像解析度的影響

奈奎斯特採樣定理是指將模擬信號轉化為數位訊號時，要求採樣頻率fs要大於模擬信號中最高頻率fmax的2倍,即fs＞fmax才可以通過採樣之後的數位訊號準確地重建出模擬信號。對於顯微圖像的數位化，其最高頻率就是由物鏡的極限解析度決定的，採樣頻率也稱為空間採樣率，一般實際應用時要求空間採樣率為物鏡的極限解析度的2.8倍左右。

顯微鏡的極限解析度r是由物鏡的數值孔徑NA和波長λ決定的，滿足式①                    

因此波長越短，顯微鏡的極限解析度越高。

空間採樣率s的計算式②為

式中p為數字圖像傳感器像素的邊長；β1為顯微物鏡的放大倍率；β2為攝像鏡頭的放大倍率。

因此改變攝像鏡頭的放大倍率，可以改變空間採樣率。選用一組不同放大倍率的攝像鏡頭實現不同的空間採樣率，以研究空間採樣率對數碼圖像解析度的影響。具體實驗條件如下：

顯微鏡：BA310顯微鏡。

光源：白光LED和滷素燈（可互換），帶有550/20nm的幹涉濾色片。

顯微物鏡：根據式①，其極限解析度為0.45μm。

攝像頭：CM3-U3-50S5M黑白攝像頭，像素邊長為3.45μm。

觀察標本：採用USAF1951鑑別率板（如圖1）所示，40×/0.75顯微物鏡可觀察的極限線對數為2048（11-1組）。

圖1 USAF1951鑑別率板

攝像鏡頭倍率：0.35×、0.5×、1×分別對應三種不同的採樣率，採集的圖像如圖2所示，結果如表1所示。

圖2 不同攝像鏡頭下的數碼顯微圖像

表1 不同攝像鏡頭下的數碼顯微圖像解析度

由此可見，在沒有滿足採樣定理的情況下即欠採樣，數碼顯微圖像解析度會降低；在過採樣的情況下，並不會帶來數碼顯微圖像解析度的提升。

光源對數碼顯微圖像解析度的影響

式①提及的波長λ是最終被傳感器接收的波長，此波長與傳感器響應曲線和光源光譜特性有關。作為傳感器，人眼的響應波長為400~700nm，即通常說的可見光，如圖3所示。而對於數字圖像傳感器CCD/CMOS，其響應波長更寬，包括人眼不敏感的紫外和近紅外部分，其中近紅外的波長更長，如圖4所示，這會導致顯微鏡解析度的下降。因此當光源的光譜包含有人眼不敏感的近紅外光譜或者紫外光譜時，在使用數字圖像傳感器時就會有影響。顯微鏡中常用的光源有白光LED和滷素燈，其中白光LED的光譜是450~700nm，如圖5所示，與人眼的響應曲線比較接近，而滷素燈的光譜為400~2500nm如圖6所示，包括了更長波長的紅外部分。在分別使用滷素燈和白光LED時，由圖像傳感器得到的結果是有區別的，如圖7所示。

 

圖3 人眼的響應曲線

圖4 相機的響應曲線

圖5 LED光譜曲線 

圖6 滷素燈光譜曲線

表2為不同光源下的數碼顯微圖像解析度，可以發現，人眼在不同光源下觀察到的極限線對是一樣的，都是2048線對，而對於數碼顯微圖像，採用滷素燈時，觀察到的解析度會有所下降。主要原因在於滷素燈有紅外光譜，人眼直接觀察時會將紅外部分濾掉，所以效果與LED相當，而數字圖像傳感器可以響應滷素燈的紅外波長，所以解析度會下降。解決辦法就是數字傳感器前放置一個紅外濾色片（俗稱IR-cut），將滷素燈的紅外部分濾除，得到接近於人眼的響應曲線，這樣就與目視觀察結果一致。

圖7 滷素燈和LED時的數碼顯微圖像

表2 不同光源下人眼觀察與數碼顯微圖像解析度的比較

因此在使用數碼顯微鏡時，應嚴格遵從採樣定理，並深入研究數碼顯微鏡各個關鍵部件，這樣才能選擇合適的攝像鏡頭、光源、濾色片等，才能滿足採樣定理，準確重建出數字圖像，達到最佳的觀察效果。

本文摘自：陳木旺. 淺析數碼顯微鏡解析度的影響因素[J]. 光學儀器, 2017, 40(3).

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