專家小談|常用商業化超高解析度顯微鏡概覽(含圖)

使用顯微鏡，是為了實現人力所不能及的事情。顯微鏡一直是生物學家從事研究工作、探尋生命奧秘必不可少的利器。為了看到更精細的生命體精細結構，研究人員對顯微鏡技術更高解析度的追求從未停止。

早在19世紀初，John Herschel和George Airy分別提出，點光源通過理想透鏡成像時，由於衍射而在焦點處形成的光斑。這種中央明亮、周圍有一組較弱的明暗相間同心環狀條紋的光斑，在第一暗環以內的的中央亮斑稱作艾裡斑，在數學中通常用點擴散函數PSF來表示^[1,2]。如圖所示，當兩點之間的距離大於埃裡斑時，才能被解析出來，可以被解析的最小距離即為解析度。

德國物理學家Ernst Abbe在此基礎上提出了解析度的解析方程Angular Resolusion，可以用來描述人眼、相機、物鏡等一系列成像設備的解析能力。他將這個假說應用的物鏡上第一次提出了物鏡的數值孔徑（NA）的概念，並在1873年提出了決定物鏡解析度的方程^[3]。1896年，Lord Rayleigh對這個方程做了z軸的測算^[4]。具體如下：

其中d代表解析度，表示可以解析的兩點之間最小距離；λ代表入射光波長；NA即為數值孔徑，由光的最大入射夾角決定。

 

圖1：（a）埃裡斑示意圖，中央明亮、周圍有一組較弱的明暗相間同心環狀條紋的光斑。（b）可以解析的兩個相鄰埃裡斑。（c）無法解析的兩個相鄰埃裡斑。（圖片來源於網絡）

因此，20世紀的顯微鏡生產商們主要通過提高物鏡的數值孔徑來提高物鏡的解析度。但是，由於衍射的存在數值孔徑的提高是有極限的，衍射極限限制了系統的解析度。

極限是用來打破的

幾十年以來，研究者們採取了不同策略進一步了提高顯微鏡的解析度。 有一些盡在衍射極限之外適度地提高了解析度，比如共聚焦成像時採用更小的針孔大小、藉助於反卷積或者神經網絡算法^[5,6]、4Pi顯微鏡^[7]和結構光照明顯微鏡技術^[8]等等，這些技術不需要特殊制樣，解析度提升一般在2倍左右（100-150nm）。除此之外，還有另外兩種被稱為Nanoscopy的超高顯微技術：一類是採用受激輻射或其他方法對發射光PSF進行擦除的確定性超高解析度顯微鏡，如STED、GSD、RESOLFT和SSIM等^[9,10]；另一類是基於螢光分子隨機定位的超分辨技術，使得相鄰的螢光分子在不同時間發光，從而將它們分辨開來，如STORM、PALM、PAINT、dSTORM等等^[11,12]。這兩類技術都可以將顯微鏡的成像解析度推進到100nm以內，相較於螢光分子定位技術而言，第一類技術對生物制樣要求相對容易，因此在常規生物實驗室研究中應用更加廣泛。

常用商業化超高顯微技術

隨著技術的發展，硬體和軟體都更趨於穩定，超高分辨顯微技術也有了越來越多的商業化產品。由於成像技術和成像需求的多元化，根據成像需求和樣品特點來選擇合適的超高解析度顯微鏡技術對用戶來說相當重要。在此，我們針對幾類常見超高分辨顯微鏡技術在生命科學領域中應用做簡要介紹。

（1）反卷積計算技術

這是一類最早走進生物學應用的超高解析度技術，它主要基於圖像計算。只要有光線傳播就存在卷積現象，在光學成像過程中也是如此。一般來說顯微鏡成像中的信號模糊主要受卷積和噪音兩方面因素影響。因此，採用適合的採樣方式和去卷積算法可以很大程度上提高圖像的解析度和信噪比。這類技術對物鏡的品質要求較高，需要物鏡的PSF參數達到可以計算的標準才能有比較好的效果；另外，傳統的去卷積技術也對成像的像素點密度有所要求，需要參考Nyquist定律來判斷採樣頻率是否達到需求。

 

圖2. （a）PSF在成像過程中的影響。（b）螢光顯微鏡圖片去卷積前（右）和後（左）

（圖像來源於網站）

目前市場上此類產品主要分為兩類，一類是反卷積顯微鏡，另一類是單獨的反卷積軟體。一般來說，反卷積顯微鏡是基於寬場螢光顯微鏡設計的自動化成像系統，綜合考慮了特定物鏡的PSF、採樣頻率和相對應的反卷積算法，因此成像速度快、操作簡單。而單獨的去卷積軟體需要用戶了解該圖像處理方法對樣品、物鏡和採樣方式的要求，並匹配合適的分析方法。雖然操作有一定的門檻，但是這類軟體針對的顯微鏡種類較多，從螢光顯微鏡到共聚焦乃至超高解析度顯微鏡都有相應的算法，一般成像技術都可以通過去卷積算法進一步提高解析度。

（2）基於共聚焦的超高技術

針孔（Phinhole）是雷射共聚焦顯微鏡成像中的必要組件，在共聚焦成像中通過針孔來去掉焦平面以外的雜散光，從而實現層掃的效果。而針孔的大小除了影響層掃的厚度之外還影響成像的解析度。當針孔縮小時，層掃厚度變薄、xy和z軸解析度提高（PSF減小）、可檢測的信號減少。我們可以使用較小的針孔大小（0.5AU）和去卷積技術結合得到解析度和信噪比較高的圖像。 

圖3. 共聚焦側向解析度與針孔大小的關係。在針孔小於1AU的情況下，針孔越小解析度越高。（圖片來源於網絡）

由於上述方法在實際使用時會大大降低光效率，無法對較弱信號實現超高解析度成像。近幾年來，基於這種解析度提高方式也有兩類商業化產品推出，一是基於陣列檢測器的Airyscan技術，它利用帶有32 個同心排列的檢測元件一次性採集1.25 AU的信號。單個檢測元件可以檢測0.2AU左右的信號，在針孔變小和點結構光運算的基礎上，成像解析度和靈敏度都得到了明顯地提高。另一種是基於轉盤共聚焦的超高成像技術，以yokogawa的為例，這種技術並通過光學變倍達到針孔信號擴束的效果並採用點結構光運算，提高解析度。

圖4. （a）Airyscan檢測器示意圖[13]。（b）Sora轉盤共聚焦示意圖。
（右圖來源於網絡）

這兩種技術總體上來說解析度相當，在120-150nm左右，去卷積處理後都可以進一步改善圖像解析度和信噪比；相較而言，Airyscan對弱信號更加靈敏，而基於Sora等技術的成像速度更快。

（3）基於結構光照明的超高技術

1995年，早在SIM的概念提出之前，Guerra便通過光柵旋轉的方式得到了更高解析度的圖像，隨後的研究發現通過類似照明手段和傅立葉變換的方法可以收集到觀察區域外的頻域信號從而能夠重構出更高解析度的圖像。這種光學成像技術近年來發展迅速，目前已經有更多的照明方式和相應算法出現，而這種成像方式也融合到多種成像技術中用以提高成像的效果，可以提高螢光顯微鏡、全內反射顯微鏡、光片顯微鏡等成像技術的解析度。 

圖5. 光柵式結構光照明螢光顯微鏡技術重構示意圖。（a）寬場螢光顯微鏡成像結果。（b）結構光照明成像結果，箭頭部分指的是高頻信息。（c）經過獲取不同格柵位置的圖像計算得出七個不同組分的高頻信息。（d）將七組分擬合得到包含高頻信息的高解析度圖像。（圖像來源於網絡）

目前商用的SIM技術主要集中在螢光顯微鏡和全內反射顯微鏡，解析度為100-120nm之間，對樣品折射率和樣品厚度有一定的要求，廣泛應用於活細胞成像中。

（4）基於受激輻射損耗的超高技術

除了前面提到的縮小針孔之外，使用受激輻射的方法將埃裡斑變小也可以進一步地提高解析度，這種方法也被稱為受激發射損耗（STimulated Emission Depletion，STED）顯微鏡。受激輻射，即處於激發態的發光原子在恰好是原子兩能級能量差的外來輻射場的作用下，發出與外來光子的頻率、位相、傳播方向以及偏振狀態全相同的光子的現象。由於這種現象造成原螢光發射波段信號被擦除的效果，甜甜圈形狀的同心圓受激輻射光使得螢光光斑變小，從而進一步得提高了解析度。

 

圖6. STED成像方式示意圖。（a）STED成像中用於激發光的光斑。（b）STED成像中用於受激輻射的光斑。（c）實際成像過程中的光斑。（圖像來源於網絡）

十幾年以來，這種成像技術發展迅速，cwSTED、gated STED、3d STED、MINFLUX等技術的出現，使得STED成像光漂白更小、3D成像效果更好也更加易用。相較於Airyscan和Sora技術，STED樣品的優化對於成像效果影響明顯。結合去卷積算法，一般生物組織樣品的解析度可以達到40-60nm。但是，STED樣品經常需要對螢光探針和制樣方法進行優化，尤其在進行多通道成像和Z-stack成像時。

結語

結合平時的應用，針對生物組織樣品成像中常見的幾種商業化超高解析度技術做了簡要綜述。超高解析度技術發展迅速、種類繁多，每一種超高成像技術都有明顯的優勢和短板，因此針對不同的應用目的做出相應的選擇對於用戶而言非常重要[14]。希望此次分享，能夠為其他用戶提供參考。

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作者：李曉明 上海科技大學生命科學分子影像平臺