與猴為伴九年，科學家成功培育出世界首例體細胞克隆猴

科學家花了整整九年時間，與千隻猴子在島上相伴，成功培育出了世界首個體細胞克隆猴，率先推動了我國發展出基於非人靈長類疾病動物模型的全新醫藥研究產業鏈。為什麼要做克隆猴？有何意義？在此過程中他們遇見了哪些困難？是如何克服的？

出品："格致論道講壇"公眾號（ID：SELFtalks）

以下內容為中國科學院神經科學研究所研究員孫強演講實錄：

大家好，我是來自中科院神經所的孫強，我今天跟大家分享的是我在科研過程中的一些故事。我的題目叫與猴為伴的這些年。

在講猴子之前，大家先看一下這些熟悉的動物。這些動物，我們給它統一命名叫實驗動物，比如大家都知道的小白鼠。那為什麼要做實驗動物呢？

舉一個簡單的例子，我們生病了都會吃藥，然而很多藥不一定有效，還可能存在安全性的問題、毒性的問題，因此不能用人做實驗，要先用實驗動物去做篩選工作。通過在它們身上做實驗，最後篩選出可以給人用的藥。

同時，我們需要把實驗動物做得標準化。就像高考，不能一百個考生一百張考卷，我們一定要用同樣的「考卷」來考。所以我們希望把實驗動物做得標準化，而且還需要這個「考題」有足夠的「難度」，能夠真正起到考核的作用，所以我們要對動物的基因進行操作。

大家看到這張圖上，有小鼠、有大鼠、有羊、有兔子、有狗，還有牛。如果大家了解一點進化論，就知道這些動物的進化關係跟人類相對遠一些，我們更希望用什麼動物呢？用跟我們進化關係更近的，比如猴子去做實驗。

為什麼列了這六種動物呢？因為博士畢業以前，這幾種動物我都接觸過。那我怎麼就跟猴子結緣了呢？我是做輔助生殖和生殖技術的，多數人博士畢業以後，都會選擇出國留學做博士後，然後發兩篇好的paper，再去選一個好的工作。但是有一件事改變了我的選擇。

大家可能不認識這隻猴子，它叫安迪。2001年的時候，它出生了，這是全球第一個轉基因猴，它的誕生意味著人類可以對猴子進行遺傳操縱了。也就是說，我們可以把猴子做得比較標準化，成為符合我們要求的特定「考生「的一個「考卷」，比如對特定疾病，我們可以做特定的模型。

這個技術出現後，當時我想，中國（當時）每年出口的猴子量大概3萬頭，是全球靈長類動物最大的出口國，說不定做猴子是個機會。所以在2004年，博士畢業前，我就選擇了這樣一個工作——去做猴子（模式猴）。

在講做猴子之前，先給大家看這張圖。這隻猴子，它要比安迪年齡大，1984年出生的，它叫皮特瑞，是全球第一個試管猴，通過試管技術做出的猴。當時看到這個信息，心裡覺得很不爽，為什麼？因為美國人在1983年就做了這隻猴（1983年開始做，1984年出生），而我決定做猴子的時候已經是2004年了，20年過去了，我們國家還沒有試管猴的技術，我想，有這麼難嗎？所以我在2005年7月博士畢業以後，沒有選擇出國，選擇了上山。

大家看到圖中的這座山，在雲南省的西雙版納州，下邊這條河叫瀾滄江，右邊還有一個索道，索道就是上山的通路。我在山上經常一待就是一周，就這樣，我在山上待了4年，一直待到2008年。

這是一個973國家重點研發項目，我接手的時候，這個項目已經執行了一半。因為2001年轉基因猴技術體系已經建立了，所以項目的目標是希望做出轉基因猴。我是半途去的，所以給自己定的目標是至少要做出試管猴，當然了，如果能做出轉基因猴更好。

我記得非常清楚，在2007年立春的2月4號這天，我們就做出了中國第一隻試管猴，之後又做了十幾隻猴子，但是很遺憾，沒有一隻是轉基因陽性的。這個項目結束以後，由於沒有資金的支持，我就從山上撤回來了。

回來以後，在上海待了半年多。猴子（轉基因猴）沒有做成功，也沒有發出好的文章，也不是海歸，工作的提升空間就變小了，所以猶豫了一段時間，甚至開始懷疑當時的選擇是不是錯了。

但很幸運，一個機會出現了。中國科學院神經所的蒲慕明先生找到我，讓我繼續做猴子。我很開心，因為我已經跟猴子分開那麼久了。蒲先生說在上海重新開始，我說不要在上海重新開始，那太慢了，重新建一個猴子設施需要很長時間，所以我又選擇了進島。

這是蘇州的太湖，大家都知道太湖方圓有800裡，裡邊有個西山島，上面有一個很大的猴場，有1萬多隻猴子，所以我就又到島上去陪猴子了。

去太湖跟去西雙版納不同。當時在西雙版納，我帶了幾個學生去，還有合作方配合。但是太湖，因為我想把它做得更好，就決定自己管所有的事，要自己負責所有的設施。

首先，要在島上租房。我們先租了一個類似北京四合院的地方（左圖），大概有13個房間，然後把我的人帶過去，在這裡安家。左圖中穿黃衣服的是我的管家，穿白衣服的是在西雙版納的時候就跟我一起做試管猴的獸醫；右圖是當時接近廢棄的一個實驗室，我們也把它租了下來。開始付不起租金，所以就租了大概100多平的地方。

要做轉基因猴，首先要把猴子養好。為什麼我們選這裡？因為這裡有很好的猴子設施。大家看左邊的圖，有3米的陽光可以射進猴房。因為猴子是社群性動物，它需要陽光照射，才能保證維生素的吸收，它也需要大面積的空間，所以在接近30平米的空間裡，我們一般養12到15隻猴子。

既要猴子要養好，還要完成實驗，我們要做的是輔助生殖實驗。猴子的進化跟人很近，比如在生殖內分泌方面，猴子跟人是一樣的。特別是母猴，是有月經周期的，月經周期平均28天，有卵泡生長、排卵和黃體期，而且也是單胎生殖。

我們做輔助生殖實驗，是希望拿到更多的卵母細胞，因此就要讓猴子超數排卵。超數排卵顯然不能在黃體期，黃體期給藥的話，卵是排不出來的，必須在卵泡生長期，也就是它月經來了以後，開始給它注射激素，然後到要排卵的時候，看見它排卵，再把卵取出來。

那麼就有一個問題，我需要知道每隻猴子的月經周期，如果不知道的話，就沒辦法得到卵。猴子不會告訴我們什麼時候來月經，也不能去蒙，這就需要去看、去觀察。

如果把猴子養到這樣一個籠子裡，我們做事就很舒服了。這個籠子有個拉杆，一拉就能把猴子拉過來，這樣就看得很容易。但是剛才講了，猴子是社群動物，這樣猴子會不滿意，它會抑鬱，健康狀態也下降。那怎麼辦呢？

在西雙版納山上的4年期間，我就思考過這個問題。在西雙版納我換了3批猴子，每批大概做半年左右就不行了，廠家很負責地給我換。但是我的資金有限，我必須把每個猴子都用好。我們知道猴子很聰明，所以我就要求我的獸醫要跟它做朋友。當然了，不是簡單做朋友，而是要跟猴子長時間待在一起，教會它做事。

這裡有個視頻，就是我們怎麼看猴子的月經。這是2011年來到我這裡工作的獸醫，叫聶豔紅。她來的時候還是實習，在這個猴房待了三年以後，她就可以很容易地讓這十幾隻猴子聽她的話。

比如要看猴子的月經，她給猴子一個指令，好多猴子就會停在那裡，讓她去做這件事，這樣就解決了大問題。現在我們島上a大概有1000多隻猴子，每年看猴子的月經累計要看5萬多次。

我們還要給猴子打針，就是給它注入激素，也要在這裡完成。不能把它放單籠裡，因為它的健康狀態會下降。另外猴子平時會生病，比如腹瀉、肺炎或者咬傷，我們都要處理，熟悉以後其實也很easy。

這是我的另一個獸醫。這隻猴子生病了，獸醫要去給它打一針，不用去追它，只要給它一些指令，它就停在這裡了。每次猴子超排，從月經來的第一天開始，一般要打12天，一天打2針。

就這樣，我們養好了猴子。動物好是基礎，基礎好了，我們還要做事，做事得先搭臺子。

我們租的是廢舊設施，留下好多猴籠，為了節約資金，我就繼續用舊的猴籠。但是有些猴子不老實，比如一些懷孕的猴子，它們有時候會把籠子給拆掉。籠子壞掉了，猴子就跑掉了，這是很麻煩的事情。

如果讓廠家來幫忙維修，廠家經常反應很慢，要等兩三個月。所以後來我就招了一個會做電焊的小夥子，給他買了電焊機，一旦有問題他就可以馬上處理。不但如此，我們的實驗室也是自己裝修粉刷的，車篷也是我們自己修的，大家都以我們的平臺為家，自己弄。

平臺搭建好了，就要做出真正的模型，給藥物研發出「考卷」。舉一個例子，實驗期間我們做了這樣一個模型：把一個孤獨症相關的基因轉到猴子裡，結果發現部分猴子出現了這種情況：猴子總是繞一個方向這樣轉來轉去，就像圖中顯示的這樣。

我們知道患有孤獨症的小孩會有刻板行為和社交障礙，猴子也是一樣。把兩個猴子放在一起， 正常的猴子會很開心，它們會聊聊天或者做個遊戲。但是把我們這兩個轉基因猴放在一起，它們互相不理睬，都躲到角落裡。

這項工作我們2011年就做出來了，經過一系列的行為學表型分析，得到了它的F1代。《自然》雜誌接受了我們的文章，這項工作也獲得了2016年中國的十大科學進展獎。

我們還做了很多其他動物模型，但是發現了一些問題：用前面的方法做的猴子，由於基因型不一致，不能做複雜操作。假設猴子是一張「考卷」，我不能在它身上出很複雜的題，比如同時改變好幾個基因，改變3個或4個基因，這點做不到，因為在胚胎學上效率低，而且猴子的遺傳背景也不一致。

如果大家有一點生物學背景的話，就知道小白鼠是可以通過連續20代近交，得到近交系，近交以後遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，連續20代也就頂多10年時間，而且這件事在上個世紀初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟時間、傳代時間要5年，做20代就要100年，我相信這樣做的話，沒人能做得成。

所以，我雖然能出「考卷」，但是這個「考卷」並不能真正把我想要的東西「考」出來，也就是說這個「考卷」出得太簡單了，不能做成模型。那麼，有沒有辦法能做成模型呢？有，就是通過克隆。

我給大家介紹一下克隆的過程。大家看上面這張圖，我們先從紅色的猴A取出體細胞，再從藍色的猴B取出卵母細胞，然後把卵母細胞的核去掉，核是遺傳物質，把遺傳物質拿掉，把體細胞跟卵母細胞放到一起，然後把它激活，變成一個胚胎，移到橙色的猴C，最後生出一隻猴子，它就是猴A的克隆。

1997年第一個克隆哺乳動物的「報導」，就是克隆羊多莉。那為什麼克隆可以解決上述問題？因為通過克隆我可以在體細胞上做遺傳操作，細胞可以在體外無限增值，我可以拿到106、107……很多很多的細胞。

我們對來自猴A的體細胞進行體外基因編輯，成為單個細胞，拿這個細胞再去克隆的話，生出的猴子就帶有這個基因。

最關鍵的一點，剛才說了，猴子有一個大問題，就是它的傳代時間在5年以上。比如我出一張「考卷」想快速「複印」給很多人去用，給藥廠做藥物篩選，可以用猴子做模型，但是要等五年才能把這猴子「複印」出來，這樣的效率，做生物學是等不起的。

那有沒有快速「複印」的辦法？我們知道猴子的懷孕期是160天，也就是說160天我能拿到一個帶有遺傳操縱的克隆猴。如果連續做，一年內我就有可能拿到很多這樣的克隆猴，而且這些猴子的遺傳背景是一致的，都來自這個體細胞的猴A，它的基因型也是一致的。

這樣就完全解決了我前面說的那些問題，這個「考卷」是好用的，而且能夠快速拿到很多「考卷」去給大家用。但是這件事要做成，首先就是要能做克隆猴，做克隆猴有點難。

1997年克隆羊多莉誕生後，有二十幾種哺乳動物都克隆出來了，大家會想，那猴子有沒有人在做？其實2002年就有人做，到2003年的時候，美國匹茲堡大學的傑瑞·沙騰教授也費了很大勁兒在做這件事。美國有八大靈長類中心是國家支持的，其中最早的靈長類中心叫俄勒岡靈長類中心，大概有7000多隻猴子在那裡存著。傑瑞·沙騰教授依靠著靈長類中心，曾經一次性做了700多個卵，然後移植到30多個猴子體內，最後都沒生，他當時很失望。

於是傑瑞·沙騰教授得出一個結論，就是用現有的方法做不出體細胞克隆猴。為什麼？大家看上圖，圖B是細胞分裂的時候形成的一個好的紡錘體。傑瑞·沙騰教授發現，克隆猴的胚胎在做核移植的時候，會把形成紡錘體的關鍵蛋白去掉，導致紡錘體不能成形，細胞就不能正常分裂，這樣胚胎也不能發育，所以他覺得肯定做不成了，他把相關paper也發到《Science》了。

之後，俄勒岡靈長類中心的另一位教授——米塔利波夫，他不服，他覺得這可能是技術問題，要去解決。所以他一直堅持在做，發了很多文章。2007年的時候，他接受一個雜誌的採訪，說他已經用了15000枚卵來做這個猴子。到2010年的時候，他發了一篇paper，就是把克隆胚胎移到10個猴子體內，但是只有1隻懷孕，但是懷孕到81天，這個猴子流產了。

我剛才說了，猴子懷孕期是160天，81天代表什麼？代表路程已經走了一半。2012年我們啟動這個項目時，蒲先生對我說：「米塔利波夫已經把這條路的前一半走完了，我們要把後一半走過去。」但是後一半有點難，最關鍵的是要能解決猴模式動物構建中的一些問題。

我們知道小鼠多胎生，卵母細胞資源無限，因為小鼠好養，而且繁殖快。那家畜呢？家畜是我們的食物，它的卵巢就是我們吃肉的副產品，所以卵母細胞資源也很豐富。但是，我們知道猴子有月經，它不像小鼠繁殖那麼快，它的卵母細胞資源有限，所以我們不能去賭。

米塔利波夫用了15000枚卵都做不出來，15000枚是什麼概念呢？2012年項目啟動的時候，我們大概有300多隻猴子，都是可以超排的，把所有的猴子的所有周期都用上，都拿不到15000枚卵。所以我們要一步步地解決問題。

我們總共用了接近五年時間去解決這些問題，前邊都是失敗、失敗、失敗，最大的失敗出現在2017年的8月。大家可能知道，2017年年底的時候，我們的克隆猴中中、華華誕生了。其實在2017年8月的時候，我們就得到了兩隻克隆猴，一隻在140多天的時候生出來，活了三個小時，沒有肺呼吸，死掉了；另一隻活了30個小時也死掉了。

那個時候我們的失望達到了極點，就像買彩票，彩票中獎號碼是10個，第1個號碼到第9個號碼都是對的，然後到第10個號碼突然錯了。這種感覺讓人很失落。當時我們團隊只有三個人，就是管細胞的管家、第一作者劉真和我。太湖很大，我就帶他們到湖邊轉一轉，散散心。

我跟他們說，我們要從失敗中走出來，我們已經有很大的進步了，因為猴子已經到full-term（足月）了，不像米塔利波夫的只是一個流產的組織，我相信我們一定能做出來。2017年年底，我們終於成功做出了克隆猴。

我必須要介紹一下我們的獸醫團隊。大家知道，人類和猴子在進化上的共同的祖先曾經生活在大草原上，而大草原上有很多猴子的天敵，所以猴子在生產的時候，都選擇後半夜，因為這樣在進化上會有優勢。如果它選擇白天生產，很可能被敵人、捕食者發現。

克隆猴也是這樣，經常在後半夜生產，而且克隆猴經常會難產。那怎麼辦？猴子快臨產的時候，它也不會告訴我們。沒辦法，我們就只能發揮人力——獸醫進行監控。

在猴子臨產前的一個月，也就是130天左右的時候，我們把它放到紅外攝像機下，讓我們的獸醫24小時去看是否有臨產症狀，一旦有臨產症狀，就打電話給主獸醫，給猴子做助產或者剖腹產。

所以我要求我的獸醫電話不能斷電，不能靜音，還要24小時開機。猴子很有脾氣，它經常後半夜響，所以獸醫經常半夜起來。因為經常這樣半夜爬起來，所以有一天我們的獸醫發了個狀態，說半夜的電話鈴聲像一聲驚雷，他懷疑自己得了職業病。

但是這份工作是值得的。2017年11月27日，我們的第一隻克隆猴，中中，在凌晨3點鐘剖腹產生出來了。12月5日第二隻克隆猴，華華，在半夜11點多剖腹產生出來了。上面這個照片就是中中和華華。

這裡有個視頻，是2018年五月底，克隆猴中中華華半歲的時候拍的，它們剛剛斷奶。我們把它們跟兩隻普通的食蟹猴放到一起群養。

從毛色上看，兩個毛色有點泛黃的是克隆猴。但從外表很難分清哪個是中中，哪個是華華，我也要根據它們的行為狀態來區分。大家看視頻，中中喜歡做一個動作，就是抱著它的小夥伴，而且它非常喜歡做這個動作，這是它的標誌性動作。

真的很幸運，我們團隊經過努力，終於把克隆猴突破了，但我覺得這只是個新起點，我們希望在這個基礎上能做更好的模式動物。

最後，我要首先感謝蒲先生，當我在西雙版納做猴子做不下去的時候，他給了我一次機會，並且在這九年一直支持我。也感謝我團隊的核心劉真，他在博士畢業的時候發了《Nature》文章，本可以去找更好的工作，但他繼續在我這裡堅守。還有我的管家蔡毅君，包括剛才我說的得了職業病的獸醫，以及我的團隊。

我還要感謝一下我的家人，因為這些年跟猴子在一起的時間，比跟他們在一起的時間都多。謝謝大家。

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