何明亮/王鑽開脫琥珀醯觸發肽自組裝：線粒體活性調節活細胞成像

【科研摘要】

模仿大自然在活細胞中協調分子自組裝的能力既重要又具有挑戰性。分子自組裝已在細胞活性控制，藥物輸送，生物標誌物成像等方面得到了廣泛的應用。儘管如此，亞細胞器限制的超分子自組裝的例子非常少見，並且在這一領域的研究仍然具有挑戰性。最近，香港城市大學何明亮，王鑽開，孫紅燕教授和中科院高能物理研究所胡毅研究員合作提出了一種新的策略，可以通過利用獨特的酶SIRT5對線粒體中的超分子自組裝進行編程。SIRT5是線粒體定位的酶，屬於NAD+依賴性組蛋白脫乙醯基酶家族。越來越多的研究表明，SIRT5參與調節多種生物過程，例如活性氧防禦，脂肪酸代謝和細胞凋亡。在這項研究中，他們設計了一類新型的琥珀醯化肽前體，可以通過SIRT5催化將其轉化為自組裝的構建基塊，從而導致在體外和在活細胞中形成超分子納米纖維。由自組裝引起的增加的疏水性顯著增強了納米纖維中硝基苯並惡二唑（NBD）的螢光。通過這種方法，作者首次實現了活細胞中SIRT5的基於活動的成像。而且，發現SIRT5介導的肽自組裝使線粒體膜電位去極化並促進ROS的形成。將該肽與三種不同的化學治療劑共同孵育可顯著增強這些藥物的抗癌活性。因此，該工作說明了用於SIRT5成像和潛在抗癌治療的線粒體限制肽自組裝的新方法。相關論文Desuccinylation-Triggered Peptide Self-Assembly: Live Cell Imaging of SIRT5 Activity and Mitochondrial Activity Modulation發表在《JACS》上。

【圖文解析】

作者假設SIRT5可以充當獨特的生物觸發物，並誘導線粒體限制的超分子自組裝。成功地合成了可以選擇性響應SIRT5並自組裝形成納米纖維的肽前體。肽前體主要由三部分組成（圖1a）：用於成像的環境敏感螢光團NBD，富含苯丙氨酸的肽片段和Ksucc（琥珀醯賴氨酸）開關模塊。先前的研究表明，螢光團NBD在疏水性納米纖維環境中可以產生明亮的螢光。引入富含苯丙氨酸的肽片段是因為芳香族相互作用有助於形成自組裝的納米纖維。Ksucc開關通過精細控制肽前體的表面電荷和疏水性而具有多種功能：1. Ksucc的羧酸基團增加了前體在水性環境中的溶解度。2.由於靜電排斥，Ksucc的負電荷會減少自組裝。3. SIRT5酶可以選擇性地調節Ksucc的疏水性和電荷。

圖1. SIRT5催化的線粒體限制的肽納米纖維自組裝。（a）前體和形成纖維的結構單元的分子結構。肽前體1和2可以被SIRT5脫琥珀醯化，分別生成纖維形成結構單元3和4。（b）由SIRT5在體外觸發的自組裝過程的示意圖。（c）通過內在化的肽前體與SIRT5酶的特異性相互作用，在線粒體內細胞內纖維形成的示意圖。

1.SIRT5觸發的肽前體的體外自組裝

成功合成這些肽後，首先檢查了它們是否對SIRT5酶促反應。肽1和2在0.005當量SIRT5和2當量NAD的存在下顯示出相當的轉化率(圖2)。通過孵育肽2進一步評估酶促反應的選擇性具有不同的酶，包括SIRT1（一種來自瑟土因家族的酶，但具有獨特的底物偏愛性）和酯酶（一種具有水解酶活性的破壞性酶）。結果表明，在這兩種酶的存在下，肽2是穩定的。綜上所述，這些結果證明所設計的肽前體可以被SIRT5去琥珀醯化並且對SIRT5顯示出高特異性。

圖2. SIRT5催化的酶促脫琥珀醯化過程誘導的納米纖維和水凝膠形成。

2.SIRT5觸發的活細胞中肽前體的自組裝

接下來研究了活細胞中超分子納米結構自組裝的可行性。在我們的研究中選擇了表達SIRT5酶的HeLa細胞。簡而言之，分別將濃度為50μM和500μM的肽2與HeLa細胞孵育。使用共聚焦螢光顯微鏡監測細胞的螢光強度（圖3）。圖3顯示了不同濃度的肽2的代表性顯微圖像。用50μM肽2孵育6小時的細胞顯示弱的細胞內螢光（圖3b），而與500μM肽2孵育的細胞顯示出明顯的細胞內螢光（圖3a）。與高濃度的肽2一起孵育的細胞內部強烈的螢光現象表明存在納米級纖維（圖3a）。

圖3. HeLa細胞中SIRT5觸發的自組裝。與（a）500μM肽2，（b）50μM肽2和（c）500μM肽2 + 300μMSIRT5抑制劑孵育後的不同時間點的HeLa細胞的螢光共聚焦顯微鏡圖像。

3.線粒體發生自組裝

為了探索納米纖維是否在線粒體區域內空間形成，作者通過孵育肽2和MitoTracker Red（一種用於特異性標記線粒體的染料）進行了共定位實驗。如圖4a-c所示，在包含NBD的納米纖維的螢光圖像和MitoTracker Red的螢光圖像之間可以觀察到實質性的重疊，表明形成的納米纖維確實位於線粒體區域。此外，在細胞的其他區域如細胞核中未觀察到明顯的NBD螢光。線掃描圖（圖4d）還證明了肽2納米纖維的螢光與MitoTracker Red的螢光重疊良好。這些數據強烈表明兩種染料之間存在顯著的共定位水平，這證實假設，即肽2被SIRT5脫琥珀醯化並主要在細胞的線粒體區域自組裝。此外，結合細胞分級分離和TEM成像實驗來證明線粒體中納米纖維的選擇性形成。簡而言之，首先將HeLa細胞與肽2一起孵育，然後通過文獻中所述的方案分離細胞核，線粒體和胞質溶膠級分。進一步的TEM可視化清楚地表明，線粒體級分中存在納米纖維，而其他纖維中則沒有。諸如細胞核和胞質溶膠（圖4e）。納米纖維的尺寸也與圖2c所示一致。另外，沒有肽2孵育的對照細胞僅顯示出無定形物質（圖4f）。結合螢光和TEM成像實驗，這些數據有力地證明了可以用肽2在線粒體中選擇性地形成超分子納米結構。

圖4.共定位和細胞分離實驗。用500μM肽2和100 nM MitoTracker Red孵育的HeLa細胞的螢光共聚焦顯微鏡圖像；（a）MitoTracker Red通道；（b）NBD頻道；（c）覆蓋。比例尺= 20μm。（d）在（c）中橫跨HeLa細胞的線性區域的線掃描圖。（e）與肽2過夜孵育後的線粒體級分的TEM圖像。（f）沒有與肽2過夜孵育的線粒體級分的TEM圖像。

4.自組裝改變線粒體活性並誘導ROS形成

為了檢查由SIRT5介導的肽自組裝是否可以調節線粒體活性，作者進一步合成了沒有螢光團的肽2類似物Fmoc-FFFGKsuccG（肽5，圖5a）。由於該肽不含螢光團，因此不會干擾細胞成像實驗所需的螢光測試。

圖5.（a）肽5的化學結構。（b）與SIRT5和NAD+在緩衝液中孵育的肽5的TEM圖像。（c）用肽5孵育HeLa細胞後，線粒體級分的TEM圖像。比例尺= 200 nm。（d）暴露於500μM肽5 6 h的HeLa細胞中JC-1染色的螢光圖像。比例尺= 50μm。（e）HeLa細胞中與500μM肽5孵育6 h的Mito-SOX染色的螢光圖像。對照：在不使用肽5的情況下用載體處理的細胞。比例尺= 50μm。（f）定量分析（d）中紅色螢光與綠色螢光的比率，P = 0.006。

實驗結果表明，SIRT5可以有效地將85％以上的肽5脫琥珀醯化。接下來，通過水凝膠和TEM實驗證實了具有SIRT5的肽5的體外自組裝活性（圖5b）。隨後，將HeLa細胞與肽5孵育過夜，並分離線粒體級分。實際上，在處理肽5後，線粒體部分中發現了大量的納米纖維（圖5c）。另一方面，在未添加肽5的對照細胞中未發現納米纖維。此外，通過ESI-MS分析在線粒體級分中發現了肽5的去琥珀醯化產物，進一步證明了肽5可以被活細胞中的內源性SIRT5脫琥珀醯化。這些結果共同證明，與肽2相似，肽5可以被內源性SIRT5脫琥珀醯化並在線粒體中選擇性地形成納米纖維結構。

5.肽的自組裝增強了不同藥物的抗癌活性

作者測試了肽5的細胞毒性（圖6d）。孵育72小時後，濃度為500μM的肽本身對HeLa細胞的細胞毒性較低，表明該肽具有良好的生物相容性。令人欣慰的是，將肽5與這三種藥物共同溫育可顯著提高其對HeLa細胞的殺傷能力。例如，將0.2 M DCA與肽5共孵育會導致90％以上的細胞死亡（圖6a）。同樣，將低劑量的順鉑（0.4μM）與肽5一起使用會導致80％以上的細胞死亡（圖6b）。2.5 nM紫杉醇與肽5的共孵育殺死了90％以上的細胞（圖6c）。

圖6.用（a）DCA，（b）順鉑，（c）含或不含500μM肽5的紫杉醇和（d）僅含肽5（0–500μM）孵育的HeLa細胞的細胞活力測定。

全文參見：

doi.org/10.1021/jacs.0c08463

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