第一作者：Qing Liu, Kaiwei Wan
通訊作者：Zhen-Gang Wang, Hui Wang, Baoquan Ding
通訊單位：國家納米科學中心，北京化工大學，中國科學院大學
無輔因子組氨酸多肽自組裝模擬酶設計及表徵
肽自組裝模擬酶催化活性及催化機理
肽自組裝模擬酶穩定性考察
由蛋白質構成的天然酶具有催化高效性和特異性，在生物體活動中發揮著重要作用。天然氧化還原酶依靠活性位點周圍的胺基酸殘基及輔因子兩者協同參與底物氧化還原反應的催化。然而當環境酸度和溫度較高時，會導致參與反應的胺基酸殘基亂序和輔因子錯位，進而引起蛋白質的不可逆失活。基於天然酶活性中心的催化原理和結構設計所開發的超分子催化劑有望實現無輔因子的催化作用，為酶的反應機制和設計提供了新的思路。辣根過氧化物酶（HRP）的活性中心是以胺基酸殘基構成的三聯體His42-Arg38-His170[1]，其鄰位配體和遠端殘基分別位於輔因子血紅素的兩側，以降低血紅素到反應中間體的能壘。國家納米科學中心丁寶全課題組已設計出以核酸/多肽/殼聚糖自組裝構成的過氧化物模擬酶[2-4]，具有與天然酶HRP相當的催化效率，但它們均需輔因子血紅素的參與。對於輔因子依賴的氧化還原酶及其模擬酶而言，其是否能在缺乏輔因子的情況下，僅依靠分子組裝和胺基酸殘基的協作而實現催化功能，結果尚不清楚。
要點1. 無輔因子組氨酸多肽自組裝模擬酶設計及表徵
富含組氨酸的多肽已顯示出可形成β-摺疊二級結構的能力，且組氨酸側鏈咪唑可作為受體或供體參與氫鍵的相互作用，這為咪唑可定向協同參與激活過氧化氫還原反應提供了條件。基於此，作者首次設計了一種無輔因子參與的非共軛超分子催化劑，該催化劑由含NH3+和COO-末端基團的低聚組氨酸肽通過電荷相互作用、氫鍵和π-π堆積組裝成有序的晶體結構，通過相鄰官能團協同作用表現出H2O2還原及歧化反應的催化活性（圖1）。
圖1. 無血紅素組氨酸多肽自組裝催化劑的設計及結構：(a) 辣根過氧化物酶 (左) 和抹香鯨肌紅蛋白 (右)的結構及活性位點；(b) 多肽自組裝成β-摺疊和平面晶體結構材料原理圖；(c) 周期性排列的肽鏈和側鏈基團催化H2O2還原和歧化反應的工作機制。
首先，作者通過圓二色譜對其形成的蛋白質二級結構β-摺疊進行表徵，並探討了組氨酸多肽長度對該結構形成的影響，隨著長度增加，摩爾殘基橢圓率（MER）增加，光譜最大吸收波長出現紅移，β-摺疊形成的臨界濃度（CβC）減小，這均證實較長的多肽自組裝程度更高。掃描電鏡和光學顯微鏡研究進一步表明僅含有組氨酸重複序列的多肽（H2-H15）能自組裝形成大尺寸的片狀或帶狀晶體結構，當多肽鏈長度進一步增加時（H16-H20），多肽分子鏈無規捲曲增多，只能組裝形成無定形的顆粒狀結構，因此H15是此體系中最佳的多肽長度。同時，垂直表面記錄的選區電子衍射模式（SAED）顯示出形成H15納米結構的最強β-摺疊具有良好的單晶性質，高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）也中晶麵條紋清晰可見。晶面結構數據進一步表明多肽自組裝形成的納米結構是通過沿β-摺疊的鏈間氫鍵、沿β-鏈的NH3+和COO-的靜電吸附以及垂直於β-摺疊的側鏈π-π相互堆積協同作用產生。
圖2. 肽自組裝催化劑的結構表徵：(a) 組氨酸肽鏈長度對CD信號及最大吸收波長的影響；(b) 不同肽鏈長度下的CβC值變化；(c) H15肽自組裝的SEM圖像；(d) H15肽自組裝的光學顯微成像。
圖3. 肽納米結構的晶格和肽鏈排列模式：(a) 基於H15的納米結構SAED模式；(b)基於H15的納米結構HRTEM圖像；(c) H15晶體正交單元格中分子堆積的理論模型；(d) 兩種不同方向堆積的β-摺疊模型。
要點2. 肽自組裝模擬酶的催化活性及催化機理
該自組裝結構在不含有輔因子血紅素及金屬時，表現出顯著的催化H2O2氧化四甲基聯苯胺（TMB）、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或高香草基酸（HVA）能力，這證明該結構具有HRP模擬酶的催化活性。如圖4a及4b所示，較高的肽濃度會增快催化TMB顯色的反應速率，因其可促進肽的有序自組裝，從而促進大量活性位點的形成，同時不同組氨酸肽鏈長度下的催化顯色速率變化與圓二色吸收值變化趨勢一致，單體組氨酸H1無明顯信號，H15顯色效率最佳。在反應底物TMB的不同濃度下，其反應速率曲線符合酶促反應動力學-米氏方程，進一步證明其具有過氧化物模擬酶性質（圖4c）。隨後，本文還對反應體系中的活性氧物種進行了表徵及相關理論計算，1:1:1:1的EPR四重峰表明體系中有O2-·/HO2-·的生成，且檢測出TMB+·的信號，表明H15/H2O2/TMB可能參與了三元配合物中間體的形成過程。為進一步研究反應機理，作者進行了分子對接及相關理論計算，如圖5所示，催化劑通過（010）晶面的組氨酸殘基以非共價相互作用吸附TMB形成TMB-催化劑複合物， H2O2通過氫鍵和π-π相互作用擴散，進而形成三元複合物，再經歷奪氫反應、超氧自由基OOH.形成及質子轉移反應，生成水和TMB+·，催化劑最終回到初始狀態。
圖4. 肽組裝催化劑的功能表徵：(a) 不同肽長下肽濃度對H2O2氧化TMB的速率影響；(b) 1 mM 多肽濃度下肽長對TMB氧化速率的影響；(c) 飽和H2O2濃度下反應速率與TMB濃度的擬合曲線；(d) 反應體系EPR譜圖。
圖5. 催化過程的密度泛函理論模型
要點3. 肽自組裝模擬酶穩定性考察
天然酶在高溫和低pH值條件下，易發生酶的不可逆失活，因此最後作者考察了該自組裝模擬酶在溫度和酸影響下催化活性的穩定性。在室溫和高溫，中性和及酸性條件下循環十次後，此模擬酶基本保持原有活性，而HRP在同等條件下，催化活性降低幾乎90%，這證明其活性有可逆性。
圖6. 外部環境觸發的H15肽自組裝酶和HRP的失活與激活
總之，本文首次報導了在無輔因子條件下，低聚組氨酸多肽通過電荷相互作用、氫鍵和π-π堆積組裝成有序晶體狀的納米結構，可實現類過氧化物酶活性。作者通過光譜、材料及晶體數據對納米酶進行表徵，並結合催化動力學實驗及分子對接相關理論計算解釋了其反應機理，且該模擬酶具有優於天然酶的可逆性。作者進一步將成纖多肽與聚組氨酸多肽化學偶連，引導聚組氨酸形成纖維狀結構，提高催化劑的比表面積，使更多的組氨酸殘基暴露於表面，可將TOF提高一個數量級。這種無輔因子的超分子催化劑有望對設計先進的仿生催化材料提供新的思路，同時也為原始酶的反應機理提出了一種可能的假想模型。
https://www.nature.com/articles/s41563-020-00856-6
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4. Wang, Z. G.; Li, Y.; Wang, H.; Wan, K.; Liu, Q.; Shi, X.; Ding, B., Enzyme Mimic Based on a Self-Assembled Chitosan/DNA Hybrid Exhibits Superior Activity and Tolerance. Chemistry 2019, 25 (54), 12576-12582.
張曉（zhangxiao_96@163.com）
吳鵬課題組碩士研究生