自組裝構築首例無輔因子的氧化模擬酶材料

2020-12-02 X一MOL資訊

本文來自微信公眾號：X-MOLNews

副標題：北京化工大學王振剛教授與國家納米科學中心王會副研究員和丁寶全研究員Nature Materials：聚組氨酸多肽自組裝構築無輔因子的氧化模擬酶納米材料

天然的氧化還原酶（如過氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶等）主要依賴活性位點附近精確排布的胺基酸殘基和輔因子（Cofactor）相互協作高效地催化底物的氧化還原反應，其中輔因子對於電子傳遞起著關鍵的作用。但是，在環境升溫或pH波動時，隨著蛋白質的解摺疊，催化性殘基的空間排布發生改變，導致輔因子的移位、脫落甚至聚集，使得酶不可逆地失活。基於酶催化原理和結構特點發展起來的超分子自組裝，為酶的從頭設計與構造提供了有效的途徑。在前期的工作中，研究者通過生物分子自組裝，構建了輔因子依賴性的類酶活性位點（Chem. Eur. J., 2019, 25, 12576; ACS Catal., 2018, 8, 7016; ACS Nano, 2017, 11, 7251）。對於輔因子依賴的氧化酶或模擬酶而言，是否能僅通過控制胺基酸基團的排列和協作，實現含有輔因子的活性位點的催化能力，仍是未知數。另一方面，具有複雜結構活性位點的酶在生命起源初始階段的惡劣環境中，以何種分子組裝形式實現催化功能，仍吸引廣泛關注。


近日，北京化工大學王振剛課題組、國家納米科學中心丁寶全課題組、施興華課題組和清華大學劉冬生課題組合作，在仿酶催化領域取得新進展。研究成果以「Cofactor-free oxidase-mimetic nanomaterials from self-assembled histidine-rich peptides」為題在線發表於《自然•材料》（Nature Materials）雜誌上。


血紅素蛋白是一類以血紅素（鐵原卟啉）為輔因子的蛋白。在過氧化物酶、血紅蛋白或一系列血紅素模擬酶活性位點中，組氨酸殘基作為配體或者酸、鹼催化劑，能夠顯著提升血紅素的催化活性。考慮到組氨酸側鏈咪唑的氫鍵給體/供體功能和酸鹼催化能力，研究者設計了不同長度、以COO-和NH3+為末端的聚組氨酸肽（最短為二肽），組裝形成了可至數百微米乃至毫米級別的片狀或者帶狀單晶晶體結構或無規的米粒結構；在不含有血紅素輔因子或者金屬時，表現出了催化H2O2氧化四甲基聯苯胺（TMB）等底物的活力或者H2O2歧化反應的活力。

圖1. 示意圖：a）辣根過氧化物酶（左側）和抹香鯨肌紅蛋白（右側）活性中心結構；b）聚組氨酸多肽自組裝過程；c）聚組氨酸多肽自組裝結構催化模式。圖片來源：Nat. Mater.


研究者系統地考察了自組裝催化劑微結構和類過氧化物酶催化功能。在圓二色譜、X-射線粉末衍射和電子衍射高分辨電鏡結果基礎上，根據第一性原理計算發現，（0 1 0）晶面的氫鍵作用（源於β-sheet二級結構的主鏈）和靜電作用（源於端基基團COO-和NH3+）、（1 0 0）、（0 0 1）晶面的π-π堆積和氫鍵作用（源於側鏈咪唑）協同促進多肽鏈規整排列並形成單晶結構。晶體的形成決定了自組裝材料的比催化活力（Vi per His），表明活力與組裝能力的密切關係；進一步研究發現，聚組氨酸的組裝能力和比催化活力關聯著肽分子的濃度以及三種特徵長度（二肽、十二肽、十五肽）：組氨酸單體沒有表現出β-sheet結構信號以及催化活力；當長度超過2個殘基時，分子開始組裝，形成伸展的β-sheet結構並顯示出催化活性；當長度超過12個殘基時，分子鏈相互作用增強，使得比活力成指數級提高；當長度超過15個殘基時，分子鏈無規捲曲，不利於鏈的有序排列，比活力顯著下降。

圖2. a）十五肽自組裝結構的掃描電鏡圖（inset為帶狀結構）、電子衍射圖和高分辨電鏡圖；b）十五肽自組裝體的第一性原理計算結構模型；c）聚組氨酸肽的二級結構、活力與分子鏈長的定量關係。圖片來源：Nat. Mater.


為了揭示催化機理，研究者分別使用酶促反應動力學和電子順磁共振波譜（ERP）研究反應過程產生的中間體。酶促反應動力學實驗表明，與血紅素蛋白遵循的「桌球」機理不同（底物和產物交替地與酶結合或從酶釋放），無血紅素的聚組氨酸組裝體遵循「三元複合物」機理，即H2O2和TMB雙底物以有序或無序的方式與催化劑結合形成三元複合物中間體。電子順磁共振波譜（EPR）和自由基淬滅劑添加實驗表明，在雙底物與催化劑共存時生成超氧自由基•OOH，而僅存在雙底物或者催化劑/TMB時無自由基信號產生。痕量金屬或者I-的影響通過ICP-MS、EDTA與金屬/I-的添加實驗予以排除。結合分子對接和量子化學計算可以推論，自組裝催化劑通過（0 1 0）晶面的組氨酸殘基、以多重非共價相互作用吸附H2O2和TMB形成三元複合物，通過咪唑基與H2O2的氫轉移、超氧自由基•OOH形成、超氧自由基與TMB和咪唑-H的氫轉移，生成水和TMB陽離子自由基，最後回到初始態。需要指出的是，僅將催化劑與H2O2混合時，EPR譜顯示出羥基自由基•OH信號，這對應於O-O鍵斷裂以及催化劑對H2O2的催化分解反應。


聚組氨酸多肽催化劑的活性位點是組氨酸殘基的周期性排列形成，在經歷10次乃至數百次的加熱/冷卻或者酸化/中和循環處理後，活力沒有任何損失，而且活力的響應性變化與組裝結構的解離/重構對應，進一步證明了活力與多肽組裝的關係；但是，含有血紅素的天然酶或者模擬酶在經過十個循環處理後，活力均降低80%以上，這可能因為血紅素與殘基的脫離導致了活力的不可恢復。

圖3. a）十五肽自組裝體的催化動力學雙倒數曲線；b）電子順磁共振波譜；c）催化過程的理論模型；d）多肽催化劑（H15）與天然過氧化物酶（HRP）活力對熱處理和酸處理的響應性。圖片來源：Nat. Mater.


自組裝催化材料的厚度（（0 0 1）和（1 0 0）晶面）為數納米至微米級別，抑制了芳香性還原性底物（如TMB）與包埋在內部的組氨酸殘基接觸，降低了組氨酸的使用效率和表觀TOF（turnover frequency）。為了提高催化劑的比表面積，將更多的組氨酸暴露於（0 1 0）晶面，研究者一方面通過超聲處理降低組裝結構尺寸，將TOF提高2~3.7倍；另一方面，將成纖多肽與聚組氨酸多肽共價偶連，引導聚組氨酸形成纖維狀結構，提高催化劑的比表面積，能夠將TOF提高一個數量級。在未來的工作，將結合理論模擬對催化劑組成和結構進行進一步優化，增強催化活力。


小結


該研究為氧化模擬酶催化劑的設計提供了新的策略，提出了新的氧化還原反應催化機制，拓寬了對生物催化的認知，也為簡單的分子到具有複雜活性位點結構的輔因子依賴酶的化學演化過程提供了實驗模型。


國家納米科學中心的劉清博士和萬鎧瑋（博士研究生）為該論文的共同第一作者，北京化工大學的王振剛教授、國家納米科學中心的王會副研究員和丁寶全研究員為該論文的共同通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、中央高校基本科研業務費、北京市科技計劃、中科院戰略性先導科技專項及前沿科學重點研究計劃、科技部重點研發計劃等項目的支持科學基金等項目的支持。


Cofactor-free oxidase-mimetic nanomaterials from self-assembled histidine-rich peptides

Qing Liu, Kaiwei Wan, Yingxu Shang, Zhen-Gang Wang, Yiyang Zhang, Luru Dai, Chen Wang, Hui Wang, Xinghua Shi, Dongsheng Liu, Baoquan Ding

Nat. Mater., 2020, DOI: 10.1038/s41563-020-00856-6

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