使用互補的網絡生物墨水擴展和優化3D生物列印能力

三維(3D)生物列印的一個主要挑戰是生物墨水的數量有限，這些墨水既能滿足列印的物理化學要求，又能為封裝細胞提供理想的環境。

在這裡，研究團隊解決這一限制，暫時穩定生物墨水與補充熱可逆的明膠網絡。該策略能夠有效地列印通常不滿足列印要求的生物材料，其儀器參數和結構輸出在很大程度上獨立於基礎生物材料。這一方法在來自天然和合成聚合物(包括明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、海藻酸鈉、殼聚糖、肝素和聚乙二醇)的可光交聯生物墨水庫中得到驗證。

研究團隊列印了一系列複雜和異構的結構，包括支持星形膠質細胞3D培養的軟水凝膠結構。這種高度通用化的方法擴展了可用的生物墨水的調色板，允許生物製造優化以滿足細胞培養和組織工程的生物學要求。

近年來，通過開發先進的印刷模式來應對這一挑戰。例如，3D印表機可以採用透明噴嘴，從而允許在緊接擠壓之前使用紫外光(UV)照射來部分地光交聯生物墨水。這種原位交聯方法可以幫助某些初始粘度較低的光交聯型生物油墨的印刷性能，但這種方法仍然受到擠壓材料機械剛度的限制，需要支撐每一層添加劑的重量，基於懸浮液的生物印刷可能會解決這個問題。

然而，這樣的策略將需要仔細設計一種能夠支撐但不會使軟性生物墨水變形的懸浮式生物材料。雖然高度特定的生物墨水配方或定製列印方法可以解決某些生物材料系統的可列印性，但是這些不提供可以應用於不同3D列印場景的標準化方法。這一考慮突出了更具普遍性的策略的動機，該策略將生物製造窗口擴展到可列印的、細胞兼容的生物墨水的廣泛調色板上。

在這項工作中，Liliang Ouyang團隊通過使用互補性網絡生物油墨解決了這一未得到滿足的需求，這是一種廣泛適用的策略，能夠在不同聚合物濃度下有效地列印一系列水凝膠(表1)。這些生物墨水由兩個可混溶的聚合物網絡組成，它們具有互補的凝膠機制，調節製造過程的不同階段。熱響應明膠網絡在3D列印期間提供優異的擠出和結構穩定性，而可光交聯網絡允許通過共價交聯來穩定列印結構。這兩種聚合物的結合形成了互補的網絡水凝膠，其中熱可逆網絡的解離不會影響光交聯網絡(圖1a)。

圖1.互補網絡生物油墨3D列印工藝。

研究團隊表明，小範圍的列印參數可以廣泛應用於不同的生物油墨，在12種不同的聚合物和20種不同的配方上都有保守的結果。互補網絡生物墨水一致的可印刷性消除了針對順序分層調整生物墨水的物理化學性質的需要。因此，研究團隊提出了一種生物印刷的替代方法，即預先篩選不同生物油墨的生物學性能，以選擇適合生物印刷應用的最佳配方。我們使用兩個有針對性的應用來演示這一方法：篩選水凝膠硬度以支持列印星形膠質細胞的3D培養，以及確定用於礦化組織工程的最佳生物聚合物配方。這些應用展示了如何使用具有延長生物製造窗口的標準化生物印刷工藝來定量比較和優化不同的生物材料配方，以滿足印刷細胞培養和工程組織的生物學需求。

演示互補網絡生物油墨的原理：

我們以甲基丙烯酸透明質酸(HAMA)為代表的生物油墨，說明了目前印刷方法的挑戰和互補網絡生物油墨的優勢。HAMA是一種半合成的光交聯水凝膠，由於其良好的生物相容性和易於交聯而被廣泛應用於組織工程。然而，非交聯HAMA的流變特性不太適合長絲擠出和層層組裝，這種情況在使用低濃度配方時會加劇。

生物墨水庫的擴充：

研究團隊使用了一個包含12種可光交聯聚合物的文庫：HAMA、降冰片化透明質酸(HANB)、明膠甲基丙烯醯基(GelMA)、烯丙化明膠(GelAGE)、甲基丙烯酸軟骨素硫酸鹽(CSMA)、甲基丙烯酸化葡聚糖(DexMA)、甲基丙烯酸酯海藻酸鹽(AlgMA)、甲基丙烯酸甲酯(CHIMA)、甲基丙烯酸肝素(HepMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、八臂聚乙二醇丙烯酸酯(PEGA)和去冰片烯功能化四臂聚乙二醇(PEB)。

圖2.3D列印補充網絡生物墨水庫。(A)代表性圖像和(B)使用各種互補網絡生物墨水測量的3D列印管狀結構(上行，斜視；下行，俯視)的外徑和高度，所有這些都包含5wt%的螢光素-明膠。(C)使用2.5wt%PEGA+生物墨水(包含5wt%的羅德-明膠)的3D複雜3D列印結構(從左到右：格子、耳形、腦形、金字塔和三叉管結構)的代表圖像(頂行、俯視圖；底行、側視圖)。(D)印刷格子結構(2.5wt%PEGA+)的側視圖(左)和俯視圖(右)，其強度分布顯示結構均勻性。(E)37°C孵育前(0d)和孵育後(1d和4d)列印異質管狀和(F)氣管-食管模型。HAMA+(2.5wt%；透明相)和GelMA+(5wt%；綠色相)沿縱向或橫向交替列印。

互補網絡生物墨水的主要動機是實現軟水凝膠結構的3D列印，而軟水凝膠結構通常被認為是不可列印的。研究團隊首先比較了由三種互補的網絡生物墨水(HANB+、GelMA+和GelAGE+)產生的結構的機械性能與它們的無明膠結構產生的等效結構的機械性能。最初，對於互補的網絡結構，明膠組分有助於提高觀察到的壓縮模量(E)；然而，在明膠熱釋放(1天)後，這些值下降到無明膠組分的水平。這在5wt%GelMA+中表現得最明顯，它具有相對較高的初始剛度(Ef=27.7kPa±60.9kPa)，孵化後(Ef=2.2kPa±60.3kPa)降至與未摻雜5wt%GelMA相似的值(Ef=1.5wt%GelMA)。這表明明膠的加入對印刷結構的長期機械性能影響很小。此外，掃描電子顯微鏡(SEM)顯示有或沒有明膠的凍幹水凝膠在孵育1天後的微觀結構和微孔隙率相似。

圖3.3D列印軟水凝膠結構。(A)使用HAMA+生物墨水跨越不同濃度的HAMA的3D列印管狀結構的典型圖像。(B)使用0.5或1wt%HAMA+比較孵育前(0天)和孵育後(在空氣或PBS中1天)的3D列印管。(C)HAMA配方(含和不含5wt%明膠)在孵育前(0天)和孵化(1天)後不同濃度下鑄造的圓柱體的壓縮模量。雙尾Mann-Whitney檢驗，*P<0.0 5；N.S.，無顯著性(n≥3)。(D)用1.5wt%CSMA+和1.5wt%PEGA+比較孵育前(0天)和孵育後(在空氣或PBS中1天)的3D列印管。採用螢光素-明膠顯影。

圖4.含有星形膠質細胞的構建物的生物列印和培養。

圖5.探索用於組織工程的互補網絡生物墨水。

3D生物列印的一個主要瓶頸是有效的生物墨水數量很少。一個特別的問題是，許多生物材料配方在3D細胞培養和組織工程中是有效的，但被廣泛認為是不可列印的。在這裡，研究團隊引入了一個由12種互補網絡生物墨水庫組成的庫，其中包括添加5wt%明膠的可光交聯水凝膠(各種形式的明膠、透明質酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、海藻酸鹽、殼聚糖、肝素和PEG)。這些互補的網絡生物墨水對於使用熱凝膠和光交聯的3D列印非常有效，不同於它們的無膠生物墨水，後者要麼無法列印，要麼只能超過一定的濃度閾值才能列印。我們使用以前未被用作3D生物列印基礎材料的水凝膠(例如HepMA、PEGNB、CSMA和DexMA)和被認為不可列印的聚合物濃度展示了出色的印刷適性。不同的互補網絡生物墨水使用窄範圍的工藝參數進行列印，從而提供了一種範圍更廣的通用3D列印方法。

綜上所述，我們引入了互補網絡生物墨水的概念，作為3D生物列印的通用方法。此方法提供了以前未確定的生物列印功能，其中聚合物類型、光交聯動力學和生物墨水濃度都可以在不受配方印刷適宜性限制的情況下進行選擇。反過來，這為3D列印活組織結構提供了更有效的方法，從而可以容易地調整生物墨水以滿足封裝細胞的生物學要求。

研究團隊進行的軟水凝膠印花用於星形膠質細胞培養表明，互補網絡生物墨水適用於軟組織來源(例如，其他神經細胞、脂肪、腎臟、胰腺和肺)的生物構建。雖然我們已經提供了一個由12種可光交聯聚合物組成的互補網絡生物墨水庫，但這種方法應該可以推廣到其他具有不同交聯機制的水凝膠網絡，例如那些由添加化學交聯劑、pH變化、酶催化或暴露在超聲波下觸發的網絡。

唯一會造成困難的生物材料類別是那些不能與明膠混溶的生物材料和那些依賴相反熱凝膠的生物材料(例如，泊洛沙姆)。研究團隊還使用了一種非常標準的基於熱擠壓的方法，該方法與現有的3D生物列印方法兼容。總而言之，這些設計因素應該能夠使互補的網絡生物墨水在不同的生物材料系統和3D列印協議中找到廣泛的適用性，並為生物製造和組織工程提供新的機會。