目前，醫學界已經測試了包含同種異體細胞的多層皮膚替代品用於治療不愈的皮膚潰瘍。然而，這種非天然皮膚移植物不能永久移植，因為它們缺乏對於與宿主組織整合重要的真皮血管網絡。
在這裡，研究團隊描述了使用3D生物列印技術製造可植入多層血管化生物工程皮膚移植物的過程。移植物是使用一種生物墨水形成的，該墨水包含人包皮真皮成纖維細胞（FBs），源自臍帶血人內皮集落形成細胞（HECFC）的人內皮細胞（EC）和懸浮在大鼠尾巴I型膠原中的人胎盤周細胞（PC），形成真皮，然後用包含人包皮角質形成細胞（KC）的第二種生物墨水進行印刷，形成表皮。在體外，KC複製並成熟以形成多層屏障，而EC和PC自組裝成相互連接的微血管網絡。真皮生物墨水中的PC與EC內襯的血管結構相關聯，似乎可以改善KC成熟。
當將這些3D列印的移植物植入免疫缺陷小鼠的背部時，人類EC內襯結構會與傷口床產生的小鼠微血管相結合，並在植入後4周內被灌注。印刷的真皮中PC的存在增強了宿主微血管對移植物的侵襲，並增強了表皮網狀組織的形成。
3D列印可用於生成多層血管化的人體皮膚移植物，這些移植物可以潛在地克服當前無血管皮膚替代物中觀察到的移植物存活的局限性。真皮生物墨水中包含人PC似乎可以改善真皮和表皮的成熟度。
糖尿病或壓力引起的皮膚潰瘍是全世界醫學界的難題，並且隨著預期壽命的增加和糖尿病的患病率的增加，這種疾病將增加，容易患病的患者通常傷口癒合不良，無法癒合的皮膚傷口可能直接導致殘疾，並發展為局部和全身感染併發症。目前的治療包括局部傷口療法：敷料和植皮。自體皮膚移植雖然有效，但在收穫部位會產生新的傷口，這些傷口的癒合也很差，同種異體皮膚可以閉合傷口，但會觸發患者的免疫系統強烈排斥。
組織工程化的多層皮膚移植物是第三種治療選擇。在本文中，Tnia Baltazar團隊展示了使用人細胞和3D列印技術製造的多層血管化皮膚構造的製造工藝，該技術在植入免疫缺陷小鼠後通過移植物和宿主微血管進行灌注。
圖1.培養的人類皮膚FB，胎盤PC和ECFC衍生的EC的免疫表徵和表型。
（A）皮膚FBs表達β-平滑肌肌動蛋白，PDGFR-γ，PDGFR-γ和CD90，但不表達NG2，這已通過免疫螢光顯微鏡證實。胎盤PCs的α-平滑肌肌動蛋白，PDGFR-α，NG2和CD90染色呈陽性，但PDGFR-β呈陽性。
（B）對皮膚FB的流式細胞術分析證實了PDGFR-1，PDGFR-1和CD90的表達。此外，這些細胞缺乏NG2，CD31和CD45的表達。如通過流式細胞術所證實的，PC顯示PDGFR-1，NG2和CD90的陽性表達，但是缺乏PDGFR-1，CD31和CD45的表達。
（C）人ECFC衍生的ECs通過免疫螢光顯微鏡染色為VE-鈣粘蛋白陽性，並通過流式細胞術分析顯示CD31陽性表達，但CD45陽性。流式細胞儀的特異性染色顯示為綠色；同種型匹配的對照染色顯示為紅色。在來自不同供體的3次獨立分離中觀察到相似的結果。比例尺：100 m。
生物印刷皮膚移植物不同表皮/真皮隔室的生成和表徵：
為了能夠列印多層3D皮膚結構，研究團隊以前使用NaHCO3霧化來交聯膠原蛋白，在該模型中，依次沉積了8層膠原蛋白前體。在膠原蛋白和成纖維細胞的每一層之間，將霧化的NaHCO3用作交聯劑。
團隊測試了這種凝膠化方法，以製造由人原代細胞組成的血管化皮膚移植物，並將霧化時間從5秒更改為10秒。然而，霧化不能促進成纖維細胞在真皮內的均勻分布並不能支持角質形成細胞的分化（圖2A）。
圖2.體外生物列印的皮膚構造的真皮/表皮區室的優化，成熟和表徵。
（A）評估霧化的NaHCO3作為膠原交聯劑對3D生物列印結構中真皮FB分布和KC分化的影響。頂部圖像顯示為在第3天列印的構建體的z疊層落射螢光圖像的最大投影。分別用CellTrackerTM Red CMPTX和CellTrackerTM Green CMFDA染料對FB和KC進行螢光標記。下圖顯示了列印後20天的生物列印結構的H＆E染色，表明霧化膠原蛋白層時FBs的分布不均。比例尺：100 m。
（B）示意圖，顯示了人類皮膚等效物的逐層生物列印。
（C）體外成熟30天後，人類包皮和生物印記的構建體的H＆E和免疫螢光染色的代表性圖像。印刷的移植物顯示出與人包皮相似的絲聚蛋白，細胞角蛋白14，細胞角蛋白10和IV型膠原蛋白的陽性表達。細胞核用DAPI（藍色）染色。比例尺：100 m。
研究團隊開發了一種膠原交聯的替代方法，即將印刷前將細胞與pH重建緩衝液混合，然後在37C的皮膚分化培養基中孵育（圖2B）。從第4天開始，在空氣-液體界面（ALI）上培養印刷的皮膚構建體。在第30天，這些生物印刷的構建體顯示出真皮中成纖維細胞分布的顯著改善，以及隨後印刷的表皮區室的形態得到改善，所得的上皮具有組織良好的立方基底細胞粘附在基底膜上，表明成熟皮膚組織的發育。
研究團隊評估了將HECFC衍生的EC整合到生物列印的皮膚移植物的真皮隔室中時產生血管狀結構的能力。我們首先評估了皮膚分化培養基在體外誘導和/或維持內皮網絡的能力（圖3A），重要的是，在隨後的皮膚分化培養基中培養多達50天，沒有觀察到血管退化的跡象。
圖3.評估培養條件以允許內皮細胞在體外生物列印的真皮構建物中組裝。
（A）測試的培養條件的時間表：在皮膚培養基中培養4天的生物列印的真皮結構中，與真皮FB共培養表達RFP的EC（協議A）；或EGM2持續4天，然後在皮膚培養基中培養至體外培養的第37天（方案B）。
（B）用協議A培養的生物列印的皮膚構建體的活細胞螢光顯微鏡檢查，表明不存在EC網絡的形成，而協議B促進了EC網絡的自組裝和長期維護。比例尺：100μm。
（C）在第10天在皮膚培養基中體外自組裝內皮網絡的3D重建。比例尺：50μm。網格定義3D空間。
（D）對印刷的樣品進行50天的隨訪，以評估長期內皮網絡在皮膚培養基中的穩定性和生存能力。活細胞用鈣黃綠素（綠色）染色，細胞核用Hoechst（藍色）染色。
（E）列印後7天，對表達RFP的EC，Cy5-真皮FB和表達GFP的PC的共培養物進行實時成像。比例尺：100μm。
為了產生用於植入的血管化雙層皮膚構造，將皮膚和表皮隔室分為兩個階段進行印刷。首先，用人的EC和FB對經過血管處理的真皮隔室進行生物列印，並在EGM2中培養4天，以促進血管的自組裝。第二，在第4天對包含KCs的表皮隔室進行生物列印，並在皮膚分化培養基中培養直至植入，而不暴露於ALI（圖4A）。
圖4.植入前3D生物列印的血管化皮膚等效物的表徵。
（A）製造人血管化皮膚等效物的兩階段協議時間表。首先，對在EGM2中培養了4天的帶血管真皮隔室進行生物列印，其次，對表皮隔室進行生物列印並在皮膚培養基中進行培養。在第8天，將生物印刷的構建體表徵或植入免疫缺陷小鼠模型中。
（B）人體植入時H＆E和免疫螢光染色對成人皮膚和生物列印結構的代表性圖像。含有EC的生物列印的皮膚移植物顯示出人類CD31 +血管樣結構，而沒有人EC的生物列印的移植物則沒有。生物列印的皮膚移植物在表皮基底層中顯示Ki67和CK14陽性表達。含有人PC的皮膚移植物顯示層粘連蛋白5和CK10 +基底上終末分化的KCs表達增加。細胞核用DAPI（藍色）染色。比例尺：50 m。
在體外培養8天後，將帶有或不帶有人類EC和PC的生物列印的皮膚移植物植入免疫缺陷小鼠的背部（圖5A）。在一項先導實驗中，植入了14天的生物列印的皮膚移植物顯示出高度的出血和炎症，尤其是在與包含人血管細胞的移植物相比的非血管化生物列印的移植物中（圖5B）。
圖5.在免疫缺陷小鼠上植入時和植入後2周的3D生物列印的皮膚移植物的表徵。
（A）植入時有或沒有合併EC和PC的生物列印移植物的照片。
（B）植入後2周，H＆E和生物列印結構的免疫螢光染色的代表性圖像。與包含EC的移植物相比，H＆E染色顯示非血管化生物列印皮膚移植物的出血程度更高。UEA-1染色顯示存在人類EC襯裡的血管。特別是在含PC的血管化生物列印移植物中觀察到網紋的形成。比例尺：50 m。
植入後第30天，通過整合素染色評估了表皮的人類起源，整合素染色是人類KC終末分化的標誌（圖6A）免疫組織化學分析證實，生物印刷的血管化皮膚移植物的表皮是由人KC形成的。而且，在沒有EC的生物列印的移植物中觀察到明顯的收縮。在第30天對生物列印的移植物的組織學分析證實，與移植的血管化皮膚相比，沒有EC的生物列印的移植物明顯更小，並且小鼠皮膚所佔據的面積明顯更大。
圖6.植入後4周的3D生物列印的皮膚等效物的表徵。
（A）在傷口邊緣對人整合素的免疫組織化學染色，顯示3D生物列印的血管化皮膚的表皮是人類起源的。比例尺：50 m。
（B）代表性的H＆E圖像的生物列印的移植物顯示收縮的程度。沒有EC和PC的生物列印的移植物明顯較小，小鼠皮膚佔據的面積更大。生物列印的移植物和小鼠皮膚之間的邊界通過表皮薄，毛囊的存在和具有脂肪組織的真皮深層來確定。比例尺：1毫米。
（C）在植入後4周，用人EC配製的替代物包含血管結構。通過用GSL-B4染色來評估小鼠微血管的存在和小鼠巨噬細胞的浸潤。和F4 / 80抗體。為了證明灌注了人類EC襯裡的血管，在移植前30分鐘注入了螢光UEA-1。箭頭指向灌注的人類襯裡血管。血管化生物列印的移植物顯示出網紋狀結構的形成，特別是在含有PC的生物列印的移植物中。比例尺：100 m。
皮膚的多層分層結構使其成為使用3D生物列印法製作的原型組織。在這裡，研究團隊證明了3D生物列印技術可用於從形態和生物學上與人類皮膚相似的人類細胞體外製備血管化的人類皮膚。
研究團隊證明了使用源自HECFC的EC和胎盤PC來生成可植入的皮膚移植物的潛力，該移植物包括使用3D列印的可灌注微血管系統。
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