可注射的水凝膠在細胞移植、生長因子傳遞、組織再生等諸多領域有廣泛的應用。來自亞利桑那州立大學的Brent L. Vernon和Mehdi Nikkhah教授團隊開發了一種溫度響應、雙交聯的複合水凝膠。它經過血管生成肽的修飾，可用於再生醫學，特別是組織血管化。該水凝膠由合成的聚N-異丙基丙烯醯胺基共聚物和硫代明膠(Gel-S)組成，並經過模擬血管內皮生長因子的QK肽修飾。其具有溫度響應以及促組織血管化的特性，可用於細胞和藥物遞送以及血管生成的基礎研究。裝載細胞的生物混合水凝膠的製備原理如圖1所示。首先製備不同濃度的合成聚N-異丙基丙烯醯胺基共聚物和硫代明膠(Gel-S)組成的PNJHAc明膠水凝膠(1%、1.5%和2%)。然後在水凝膠混合物中分別加入量為100和200 μg/mL的QK肽。最後將各組分的預水凝膠溶液混合，置於室溫的培養箱中，水凝膠呈現一種淡淡的粉紅色。該水凝膠是通過雙交聯的方法形成的，不同的組成有不同的凝膠化時間。以100 μg/mL和200 μg/mL QK肽濃度製備的細胞載水凝膠分別稱為PNGQK100和PNGQK200。
Fig. 1. Schematic diagram of the cell ladendual crosslinking hydrogel formation in the presence and absence of QKpeptide.
為了研究水凝膠促進內皮細胞存活和網絡形成的能力，人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）被封裝在合成的水凝膠基質中，為了誘導水凝膠基質中更密集的血管網絡的形成，將細胞密度增加到3000 萬/mL，並進行進一步的實驗。增加細胞密度導致在每個樣本的整個區域內形成內皮細胞網絡。對照組的水凝膠(不含QK肽)中沒有明顯的細胞連接，但QK結合的水凝膠中存在細胞的連接。相位對比(圖2a-f)和螢光圖像(圖2g-l)顯示，在1.5%的水凝膠和3000 萬/mL的細胞密度內，HUVEC在含有QK的水凝膠內很好地分布。在培養的第5天，在QK肽濃度較高的水凝膠(PNGQK200)中有明顯的細胞連接和血管網絡形成。利用肌動蛋白纖維的Z-stack圖像(45- 60m)量化血管分支的長度和直徑(圖2j-l)，證實了QK肽的加入顯著增強了細胞網絡的形成(分支長度和直徑)（圖2m-n），並且隨著QK肽濃度的增加細胞網絡形成呈上升趨勢。Figure 2. (a-f) Phase contrast images of cell-laden(30 million/mL) 1.5% control, PNGQK100 and PNGQK200 hydrogel constructs on day1 and 5 of formed on a glass slide. (g, h, i) Actin stained images of the cellswithin cell-laden hydrogel constructs on day 5 of culture. (m,n) Quantificationof endothelial cell network branch length and diameter within the hydrogelmatrix(P<0.0001).
使用3D微流體平臺和1.5%水凝膠進一步測試細胞負載水凝膠內的血管生成。與在玻片上形成的載細胞的水凝膠樣品相似，對照組(不含QK肽)在整個培養過程中未觀察到細胞間連接。另一方面，在含有QK肽的水凝膠(PNGQK200和PNGQK100)中， HUVEC之間的細胞間連接從第1天開始出現，到第3天小管狀結構形成。第5天，水凝膠基質中有一個連接良好的三維細胞網絡形成和血管化。在第5天對血管網絡進行F-actin纖維染色，用CD31對內皮細胞連接染色。與相位對比圖一致，螢光圖也顯示了含有QK肽的水凝膠基質中形成了管狀網絡結構，而在對照條件下(即不含QK肽的水凝膠)，細胞形態多為圓形，有少量隨機發芽(圖3a-i)。定量分析血管網絡形態發現，與對照組相比，加入QK肽的水凝膠(PNGQK100和PNGQK200)明顯增加了血管分支長度和直徑（圖3j-k）。Figure 3. (a-i) Actin and CD31 stained images ofcell-laden (30 million/mL) hydrogel matrix formed within the 3D microfluidicdevice. (j, k) Quantification of endothelial cell network branching parameterswithin the hydrogel matrix indicating significantly increased branch length anddiameter as function of QK peptide concentration within the 3D hydrogel matrix(P<0.0001).
為了進一步研究細胞密度對血管生成的影響，將微流控平臺中1.5%水凝膠的細胞密度增加到5000 萬/mL。在QK肽存在的情況下，水凝膠中有一個明顯的細胞網絡形成。F-actin纖維和CD31的螢光圖像與相襯圖像吻合良好，顯示了明顯的內皮細胞網絡形成，其形成能力取決於水凝膠基質中QK肽的存在和濃度(圖4e,f)。在細胞密度為5000 萬/mL時，與對照組相比，QK加入水凝膠(PNGQK100和PNGQK200)的血管分支長度和直徑明顯增大，並隨QK肽濃度的增加而明顯增大（圖4j-k）。Figure 4. (a-c) Actinstained images of the cytoskeleton formed in the device with cell density of 50 million/mL. (d-i) CD31 expression of the cell-cell junction in the HUVECsnetwork. Quantification data for the (j) branch length (P<0.0025) and (k)branch diameter (P<0.0015) formed in the HUVECs network.
在體外優化水凝膠基質中的血管網絡形成後，研究者進一步使用免疫缺陷小鼠進行了初步的體內研究，以評估PNGQK200水凝膠在不裝載細胞的情況下的血管生成能力(僅使用水凝膠)。初步研究結果表明，與單純的水凝膠相比注射血管生成水凝膠(PNGQK200水凝膠)可導致內皮細胞的浸潤和連接)，經H&E染色的系列切片的組織學檢查顯示，含有QK肽的材料(PNGQK200水凝膠)中血管的形成有增加的趨勢(圖5)。Figure 5. Histological examination of the angiogenicproperties of control and PNGQK200 material in vivo.
綜上所述，該研究展示了一種可注射的、雙交聯的、具有良好調節性能的血管生成水凝膠，該水凝膠可以微創方式進行血管化治療。在未來的研究中，研究者計劃通過體內跟蹤研究，進一步評估血管源性水凝膠在新血管形成中的有效性。該研究是由來自亞利桑那州立大學的Brent L. Vernon和 Mehdi Nikkhah教授團隊共同完成，並於2020年2月26日在線發表於ActaBiomaterialia。原文信息：
Amrita Pal, Cameron I. Smith,Joanna Palade, Supriya Nagaraju, Byron A. Alarcon-Benedetto, JacquelynKilbourne, Alan Rawls, Jeanne Wilson-Rawls, Brent L. Vernon*, Mehdi Nikkhah*. Poly(N-isopropylacrylamide)-based Dual-Crosslinking Biohybrid InjectableHydrogels for Vascularization, Acta Biomaterialia. 2020 , doi:10.1016/j.actbio.2020.02.041.
供稿：王佳媛
審校：陳嵩
編輯：於麗麗