密西根大學《生物大分子》治療口腔感染消融的可注射光交聯抗菌...

【前沿背景】

在臨床上，由於存在引起慢性炎性疾病的複雜的微生物群落，口腔細菌感染的治療具有挑戰性。在兒童，青年和成人受試者中引起嚴重健康問題的兩種最常見病理是齲齒和牙周炎。重要的是，這兩種情況均具有「牙斑菌」，這是一種牢固附著在口腔表面的微生物生物膜，是主要的病因。齲齒是一種高度流行的疾病，其定義為硬質牙齒組織脫礦質會觸發空化作用並暴露牙本質和牙髓組織。如果得不到適當的治療，齲齒可能會導致不可逆的牙髓病理（即牙髓壞死），以及後來的根尖牙周炎-根尖周組織的炎症過程，包括但不限於骨骼。同樣，牙周炎會在細菌遇到影響軟，硬組織的牙齦溝時發生，如果處理不當，組織損傷會導致牙齒脫落。口腔細菌感染管理的主要目的是消除生物膜及其副產物。當前用於牙周和牙髓感染的治療依賴於牙齒表面和/或牙根管系統的生物力學清潔，隨後通常使用衝洗劑和/或抗生素混合物。上述消毒方法存在許多缺點，包括但不限於生物相容性問題，這是由於選擇不加的使用的毒性所致。因此，必須有一個安全的藥物輸送系統來消滅感染，阻礙疾病的進展並適當地對患處做好可靠，持久的恢復和/或再生治療的準備。

【科研摘要】

口腔細菌感染是導致牙齒和錨固牙齒的牙周結構逐漸破壞的主要原因。最近，可注射的水凝膠引起了越來越多的關注，其作為一種有針對性的微創平臺，可用於個性化治療的局部遞送。美國密西根大學牙醫學院Marco C. Bottino和Zeynep Aytac教授團隊在8月高分子頂級期刊《Biomacromolecules》發表了題為『『Hybrid Antimicrobial Hydrogel as Injectable Therapeutics for Oral Infection Ablation』』一文。

他們開發論述了可注射和可光交聯的明膠甲基丙烯醯基（GelMA）水凝膠，成功地與環丙沙星（CIP）洗提的短納米纖維一起工程化，用於口腔感染消融。為此，已將CIP或其β-環糊精（β-CD）-包合物（CIP/β-CD-IC）摻入到聚合物電紡纖維中，然後將其切成短的納米纖維，然後包埋在GelMA中以獲得可注射的混合抗菌水凝膠。由於通過β-CD-IC增強了CIP的溶解度以及GelMA的可調節降解特性，水凝膠可促進局部持續且有效的細胞友好型抗生素劑量，這是通過一系列證明減少細菌毒性的細菌測定法測得的革蘭氏陽性腸球菌的生長。總的來說，可預見到這種創新的混合水凝膠作為可注射平臺技術的巨大潛力，該技術可廣泛應用於口腔感染消融，例如牙周疾病和牙髓病理。

【圖文解析】

1. 材料的合成

使用共沉澱法以1：1的摩爾比合成CIP和β-CD的包合物（IC）/β-CD-IC（圖1a）。首先，將β-CD溶解 在水溶液中加入CIP，然後在室溫（RT）下攪拌12小時。隨後，在過濾之前將溶液在4℃下保持5h，以獲得CIP/β-CD-IC粉末。之後，將粉末在通風櫥中乾燥12小時，並進一步用瑪瑙研缽和研杵研磨成細粉。

聚二惡烷酮纖維（PDS-F），CIP負載的PDS納米纖維（PDS-CIP-NF）和CIP/β-CD-IC負載的PDS納米纖維（PDS-CIP/β-CD-IC-NF）均通過 使用定製設備進行靜電紡絲。PDS-CIP-NF和PDS-CIP/β-CD-IC-NF通過添加10％CIP（相對於聚合物為w/w）和含10％CIP（w/w）的CIP /β-CD-IC製備在室溫下，分別將其相對於聚合物的10％（w/v）的PDS溶液溶於2 mL HFIP。通過在RT過夜使用溶於HFIP的10％PDS（w/v）製備無毒PDS-F。

圖1.（a）使用靜電紡絲合成CIP/β-CD-IC和生產納米纖維的示意圖；（b）將納米纖維墊切割成短納米纖維，並與GelMA混合以製備載有短纖維的可注射水凝膠納米纖維。

3.3 明膠甲基丙烯醯基的合成與表徵

使用1 H NMR光譜定量明膠甲基丙烯酸。圖4a中的光譜證實在5.3和5.6 ppm處引入了丙烯醯胺雙鍵，這是GelMA光聚合所必需的。1.5至2 ppm之間的峰是由於甲基丙烯酸酯的甲基官能團所致，證實了明膠甲基丙烯酸的成功合成。3 ppm處的峰是由於明膠中的賴氨酸亞甲基。GelMA的甲基丙烯酸化程度在治療性分子的擴散中起重要作用。因此，它是通過丙烯酸甲酯和甲基峰與碳水化合物質子峰的相對積分來計算的（δ= 3.7–4.2）。數據表明，本文合成的GelMA具有中等（〜56％）的甲基丙烯酸化度。

圖4.（a）GelMA的1H NMR譜圖顯示了摻入明膠中的5.3至5.6 ppm和1.5至2 ppm的甲基丙烯醯基之間的目標區域。3 ppm處的信號歸因於明膠中的賴氨酸亞甲基。1 H NMR：質子核磁共振。GelMA：明膠甲基丙烯醯基。（b）擠出後水凝膠的可注射性測試連續性的代表性宏觀圖像。重要的是要注意嵌入的短納米纖維在水凝膠中的相當均勻的分布。（c）負載CIP和CIP/β-CD-IC的GelMA水凝膠和GelMA的酶促降解。統計分析表明，對於2.5％的裝有CIP和CIP/β-CD-IC的GelMA和GelMA，其降解速度明顯快於10％的GelMA組。（d）在7天內CIP從GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF（2.5％和10％）和GelMA-PDS-CIP-SF（2.5％和10％）的釋放曲線。

3.4 水凝膠的可注射性

全身性給藥通常會導致病原細菌產生抗生素抗藥性，並增加重複感染的風險。基於水凝膠的藥物輸送系統代表了另一種策略，可在提供局部治療益處的同時預防細菌耐藥性問題。值得注意的是，可注射水凝膠還具有克服與通常用於植入預成形水凝膠的侵入性外科手術方案相關的問題的益處，該問題可能導致患者的疼痛，不適，較高的成本和時間。現在通常理解，低於15％的GelMA濃度產生可預測的降解速率和生物相容性。除此之外，濃度還影響藥物擴散。因此，降低GelMA濃度可導致更快的釋放速度。數據表明，可以使用胰島素（31G）針成功注射2.5％和10％的GelMA-PDS-CIP-SF和GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF（圖4b）。隨著GelMA的濃度從2.5％增加到10％，可注射性僅略有下降。擠出後沒有看到明顯的對接或間斷，因為粘度足夠低，水凝膠無法穿過針頭，因此證明了其在微創牙科應用中的前景，例如可以填充不規則形狀的牙周缺損或有效地穿透複雜的牙根根管解剖。在這裡，作者使用了一種光引發劑（LAP），這種光引發劑通常在牙科固化設備中可見。實際上，以前已經證明15％的GelMA可以成功地注入根管並原位光交聯。重要的是，取決於根管或骨缺損的深度和/或總體積，可以以逐層遞增的方式注入和水交聯配製的水凝膠，以確保均勻的交聯並因此確保其整體性能。

3.5 水凝膠的酶促降解

水凝膠降解在治療藥物的控制釋放，防止藥物快速清除和引起長期的生物學反應中起重要作用。因此，進行了配製的基於GelMA的水凝膠的膠原酶消化，以了解它們在體內可能的降解情況。如圖4c所示，2.5％的GelMA-PDS-CIP-SF和2.5％的GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF均在24小時內降解，而10％的GelMA-PDS-CIP-SF和10％ 168小時後，GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF降解。兩者合計，體外降解測定的結果表明配製水凝膠平臺的兩個主要方面。首先，完全降解的時間在10％的GelMA中比在2.5％的對應物中更長。其次，可能由於與水凝膠相的相互作用，短納米纖維的存在稍微減緩了降解。儘管由於天然微環境的複雜性，體外膠原酶的水平不能直接轉化為特定的體內或臨床反應，但正如先前報導的那樣，體內應發生相似的降解速率。在該研究中，已表明，將載有洗必泰（CHX）的矽鋁酸鹽納米管（Halloysite）摻入GelMA導致了可生物降解的水凝膠製劑，該製劑具有顯著的抑制細菌生長的能力，同時引起最小的局部炎症反應。值得注意的是，儘管埃洛石被認為是GRAS（通常被認為是安全的化合物），但這些生物相容性納米管不可生物降解。為了加快臨床翻譯速度，假設完善的抗生素洗脫生物可降解聚合物纖維和水凝膠形成混合注射治療劑之間的關聯可能對細菌感染的管理具有積極意義，而同時又是完全可生物降解的。

3.6 藥物釋放

CIP是一種廣泛用於口腔感染管理的疏水性藥物，但是其水溶性差會導致目標部位的生物利用度不足。重要的是，先前的研究表明，由於藥物溶解度的提高，CIP釋放可通過複合作用得到改善。此處合成了CIP的β-CD-IC，並將其摻入納米纖維中以提高生物利用度。CIP從GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF和GelMA-PDS-CIP-SF在7天內的藥物釋放曲線如圖4d所示。與GelMA-PDS-CIP-SF中的相比，GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF中的CIP釋放明顯更高。此外，正如預期的那樣，與10％的GelMA對應物相比，低濃度的GelMA（即2.5％的GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF）的CIP釋放略高。在這裡，確定了兩個關鍵的藥物釋放調節貢獻者：即通過β-CD-IC進行CIP官能化和可調遞送載體，一種建立的光交聯水凝膠（GelMA），其中控釋是其固有特徵。詳細地說，即使兩種水凝膠製劑都裝有10％CIP（相對於PDS），與GelMA-PDS-CIP-SF相比，GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF釋放的CIP量也更多。這與通過在PDS-CIP/β-CD-IC短納米纖維中形成環糊精/包裹體複合物（CD-IC）所提供的CIP的水溶性和生物利用度提高有關。其次，CIP釋放在2.5％GelMA-PDS-CIP /β-CD-IC-SF中比在10％GelMA對應物中更為明顯。如在酶促降解試驗中所見，這歸因於2.5％GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF的總體降解速度更快（圖4c）。值得注意的是，2.5％的GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF在24小時內完全降解，而其10％的GelMA對應物則需要168小時才能完全降解。值得一提的是，儘管有CIP修飾的水凝膠（GelMA-PDS-CIP-SF）是游離的（即沒有β-CD-IC），但與CIP/β-CD-IC（GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF）在酶促降解方面，10％的GelMA-PDS-CIP-SF釋放的CIP量略高於2.5％的GelMA-PDS-CIP-SF。造成這種差異的一個可能原因可能是與游離CIP和GelMA之間的相互作用相比，CIP/β-CD-IC與GelMA之間形成了更強的相互作用。總而言之，數據證實CIP/β-CD-IC能夠增加系統的溶解度，與非功能化藥物相比，從一開始就釋放出更多的藥物。

3.8抗菌功效

如前所述，該策略著重於通過在β-CD系統中形成包合物來提高藥物溶解度，從而擴大其抗菌潛力。還值得注意的是，由於短納米纖維與納米纖維相比具有更大的表面積，因此使用PDS-CIP/β-CD-IC-SF形式的短納米纖維可增強CD-IC的效果。以類似墊子的方式可以通過比較SF和NFs的瓊脂擴散數據來確認這一結果（表1）。但是，這些差異不如樣品中CD-IC的效果高。

表1.電紡納米纖維（NF）和短納米纖維（SFs）的瓊脂擴散數據

糞腸球菌的生長抑制（平均值±標準偏差，單位為mm）。不同的大寫字母表示同一列的統計差異顯著（p

3.8.1瓊脂擴散

根尖周感染以及牙髓治療失敗的主要原因是存在以浮遊細胞或生物膜形式存在的微生物。值得注意的是，糞腸球菌在原發性和繼發性牙髓感染中被稱為關鍵病原體。為了確定電紡墊，短納米纖維和用短納米纖維改性的配製的混合GelMA水凝膠的抗微生物作用，在糞便中進行了直接和間接接觸的瓊脂擴散試驗（即從14天後收集的洗脫液）樣品在PBS中孵育）。

表1列出了PDS-CIP-NF，PDS-CIP /β-CD-IC-NF，PDS-CIP-SF和PDS-CIP /β-CD-IC-SF組的抗菌數據。值得注意的是，0.12％CHX溶液用作陽性對照。總體而言，所有含CIP的聚合物纖維在直接樣品/細菌草坪接觸和洗脫液/細菌草坪相互作用中均表現出對糞腸球菌的顯著抑制作用（表1）。重要的是，糞腸球菌對PDS-CIP/β-CD-IC-NF和PDS-CIP/β-CD-IC-SF的抑制區更為顯著，表明由於較高的抑菌效力，其抑菌效力顯著（p

圖6.實驗組針對糞腸球菌的瓊脂擴散測定；0.12％CHX和PBS分別用作陽性和陰性對照。（a-b）代表性圖像顯示了靜電紡絲納米纖維（NF）墊和製備的短納米纖維（SFs）的細菌生長抑制作用。（c-d）代表性圖像顯示了混合短納米纖維修飾的GelMA水凝膠的細菌生長抑制作用。

3.8.2生物膜模型

生物膜是高度組織化的，由微生物形成的複雜實體，其特徵與浮遊懸浮液中的微生物本質上不同。眾所周知，當細菌為微生物生物膜形式時，由於細胞外聚合物提供的內在保護，它們對抗生素具有高度抗性。為了進一步解決建議的完全可生物降解的基於混合抗微生物劑GelMA的水凝膠作為口腔感染消融的可行注射治療劑的臨床相關性，作者還評估了對感染的牙本質（糞腸球菌）生物膜模型的抗微生物功效（圖7a，b） 。治療1周後，通過菌落形成單位形成測定法確定抗菌功效。與未處理組（即細菌對照組）和所有其他實驗組相比，GelMA-PDS-CIP/β-CD-IC-SF組的2.5％顯著降低了活細菌數（p

圖7.（a）通過菌落形成單位測定，工程水凝膠對被感染的牙本質生物膜模型的抗菌效力。條形柱上方的不同字母表示實驗組之間的統計學差異（p

【陳述總結】

在該工作中，通過建立游離形式的CIP/β-CD-IC或CIP驗證了用環丙沙星（CIP）洗脫的短納米纖維修飾GelMA的可行性。為此，已將CIP和CIP/β-CD-IC裝入FDA批准的聚合物（聚二惡烷酮）電紡纖維中，並將其成功切成短納米纖維，然後包埋在GelMA中，從而得到具有優化，可注射性的混合抗菌水凝膠成分。不出所料，CIP/β-CD-IC的合成改善了藥物溶解度，繼而在對細胞友好的同時又帶來了最高的抗菌作用。此外，數據表明，取決於所選的GelMA濃度，降解曲線和藥物釋放動力學都可以進行微調。總的來說，工程聚合的CIP/β-CD-IC短納米纖維GelMA平臺有望為口腔和牙科感染消融提供疏水性藥物，特別是在牙周和牙髓（即根管）應用中。但是，有必要進行進一步的研究來確定工程化雜化水凝膠作為治療藥物的微創遞送載體的體內作用，不僅可以消融感染和/或解決炎症，而且還可以消滅具有已知再生特性的分子，從而使該技術可用於在牙科和醫學中的廣泛應用。

參考文獻：

doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01131

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