血管內皮細胞支持生物3D列印建立的體外血管化骨模型的成骨作用

骨是一種高度血管化的組織，在骨骼發育過程中，血管化和礦化是同步進行的。事實上，這兩種成分都應該包括在任何可靠的和貼壁的體外模型平臺中，以研究骨生理學和骨骼疾病的發病機制。為此，Irene Chiesa團隊利用明膠納米羥基磷灰石(Gel-nHA)3D生物列印支架，建立了體外血管化骨模型。

首先，研究團隊將人骨髓間充質幹細胞(HMSCs)接種到支架上，進行了兩周的成骨分化。然後，他們將慢病毒-綠色螢光蛋白基因轉染的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)植入3D生物列印支架大孔中，在接下來的兩周培養中形成毛細血管樣網絡。

實驗分為三個實驗條件：條件1，人臍靜脈內皮細胞在1：1成骨培養基(OM)：內皮細胞(EM)中培養的骨構建物；條件2，不含人臍靜脈內皮細胞的骨構建物在1：1OM：EM中培養；條件3：人臍靜脈內皮細胞骨構建物在1：1生長介質：EM中培養。所有樣本均為工程化骨基質。

在條件1和條件3中，人臍靜脈內皮細胞在骨結構內形成管狀結構，在活組織和組織學中可以通過螢光顯微鏡看到複雜的毛細血管樣網絡的組裝。CD31免疫染色證實有明顯的血管腔形成。實時定量PCR定量檢測成骨分化和內皮細胞反應。鹼性磷酸酶和矮小相關轉錄因子2的上調證實了hMSCs的早期成骨作用。即使在條件3下去除OM，他們也觀察到明顯的成骨，明顯伴隨著骨橋蛋白、血管內皮細胞生長因子和I型膠原的上調。

這些發現表明，研究團隊在短短四周的培養中就成功地實現了一種具有強大血管化能力的骨模型，我們強調了內皮細胞的包涵體是如何更真實地支持成骨的。本文報導的方法導致了一種受生物啟發的體外骨血管形成模型，模擬了組織發育過程中發生的毛細血管的從頭形態發生。

關鍵詞：血管化骨模型、三維微生理系統、三維生物列印、生物材料。

在天然骨中，血管對骨的發育、重建和骨折癒合是必不可少的，對維持健康的骨組織也是至關重要的。血管生成是骨形成的先決條件，在膜內骨化過程中，毛細血管侵入分化的間充質區，而在軟骨內骨化過程中，肥大的軟骨細胞招募滲入的血管系統。骨和血管之間相互作用的調節失調是不同病理(如缺血性壞死、骨質疏鬆症和Gorham-Stout病)的基礎。

此外，骨組織工程體內移植的一個關鍵障礙是工程化結構內缺乏血管形成。血管化骨植入物可以有效地治療連接結構和宿主血管網絡的大型骨缺損，以維持生存能力並促進整合。此外，血管系統也是在體外工程骨平臺研究骨生物學、疾病發病機制和測試新的潛在藥物時需要包括的一個關鍵因素。

在過去的十年中，通過結合成骨前體細胞和血管前體細胞，人們進行了不同的嘗試來生成體外血管化的骨組織結構。共培養系統經常被用來同時促進成骨和血管生成。值得注意的是，在正信號反饋迴路中，細胞間通訊支持骨組織工程中同時發生的成骨和血管生成。

事實上，人骨髓間充質幹細胞(HMSCs)分泌血管生成生長因子，如血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)，促進血管生成；而內皮細胞(ECs)產生骨形態發生蛋白(BMPs)，促進前體骨細胞向成骨細胞分化。然而，共培養方法是複雜的，細胞類型、培養介質、微環境、接種方法、支架結構和材料等參數將對最終結果產生重大影響。

在過去的十年裡，生物列印越來越多地被用於支架的製造，以提供對支架設計的更多控制。生物印花使用計算機輔助轉移過程來快速製造預定義的複雜結構，並精確控制外部和內部結構。因此，與傳統技術不同的是，生物列印能夠精確地製造相互連接的多孔結構，控制支架製造中的關鍵因素，例如組成、孔幾何形狀、大小和互連性，這些因素對於創建具有不同細胞類型的有組織的構建物是必不可少的。

在這項工作中，研究團隊的目標是建立一種體外工程化的血管化骨模型，以研究血管形態發生和成骨在結構發育過程中的相互影響。為此，團隊首先實現了一種基於明膠-納米羥基磷灰石(Gel-nHA)三維生物列印支架的骨構建，該支架具有相互連接的孔隙網絡，種植了經過成骨分化的hMSCs。然後，為了簡單起見，他們將慢病毒-綠色螢光蛋白基因轉染的人臍靜脈內皮細胞(以下簡稱HUVECs)納入3D生物列印支架孔內，形成一個毛細血管樣網絡。

圖1：(A)用於製造支架的活塞驅動擠出機3D生物印表機。(B)用於列印具有垂直和側向孔隙的木樁支架的生物標繪技術示意圖；在列印過程中，犧牲支持材料為生物材料墨水提供支撐，以避免支架坍塌。(C)在Solidworks®中設計的木樁腳手架CAD模型，帶有橫向分支，可防止在非列印移動過程中材料沉積；比例尺=1 mm。

圖2：骨支架的後處理。(a-c)支架在支架材料中放置48小時。照片拍攝(A)剛列印完，(b，c)48小時後，在交聯之後。顏色的變化是京尼平-明膠反應的結果，深藍色標誌著交聯的結束。(d，e)去除Pluronic acid F-127並用外科刀片切割側枝後的支架。(F)腳手架直徑4毫米的圓柱形芯子。(g-i)巖心在(g，h)頂面和(I)側面的高倍率圖像，分別顯示軸向和側向孔隙。G和I，比例尺=1 mm；h，比例尺=500微米。

血管化骨構建：將人臍靜脈內皮細胞：人骨髓間充質幹細胞製成4：1比例的懸液，最終濃度為106個/ml，用纖維蛋白凝膠和GelMA配製成1：1的溶液。在每個支架的大孔中填充55µl的HUVECS：載hMSCs的GelMA-Fibin凝膠水凝膠，在紫外光(405 Nm)下原位交聯2min。製造工藝示意圖如圖3a所示。

圖3：(A)將HUVECs添加到骨構建物中，填充支架內整個相互連接的孔隙網絡的過程示意圖。(B)血管化骨結構發展的實驗時間表(條件1和3)和非血管化對照(條件2)。

為評價支架的形態，採用顯微CT技術獲取支架橫截面圖像。不同生物列印方向的層之間看不到塌陷(圖4a-b)。由ITKSnap®進行的支架3D重建如圖4c所示。

橫截面圖像用室內開發的Matlab®腳本進行處理，以創建代表孔隙網絡的支架微CT掃描的負片3D重建(圖4d)。Matlab®分析表明，支架孔網絡是相互連通的，軸向方形孔徑為0.92±0.14 mm，橫向孔徑為0.5±0.15 mm，孔隙率約為60%。

圖4：(a，b)不同高度取芯支架的MicroCT切片掃描，取芯支架周長突出顯示。(C)使用ITK-Snap®對支架進行三維重建。(D)由Matlab®獲得的支架內相互連接的孔隙網絡的三維重建。

在37°C的PBS 1X中進行了溶脹試驗，樣品在不改變其原始形狀的情況下吸收了水。體重在30分鐘後達到平臺期(圖5a)。對支架進行後處理和膨脹後的壓縮試驗，壓縮模量分別為36.4±9.6kPa和5.1±2.3kPa(圖5b)，復水後壓縮模量明顯下降。

圖5：(A)隨時間變化的腫脹百分比。重量平臺點(30分鐘)用紅線突出顯示。(B)後處理後剛測試的支架的壓縮模量與復水(膨脹)後測試的支架的壓縮模量之間的比較。*p值<0.001。

支架接種人骨髓間充質幹細胞(每個支架1×105個細胞)，24小時、72小時、7天、10天後進行活細胞檢測。由於京尼平是紅色螢光，所以不可能進行標準的活/死檢測中的死亡成分。圖6顯示了每個時間點的支架頂部、橫截面和底部表面的圖像。24小時後，細胞不均勻地附著在支架上，並且可以看到幾個細胞聚集體。培養7d和10d後，支架被hMSCs完全均勻覆蓋。

圖6：支架在不同時間點上(左)、橫截面(中)和下(右)表面的活體化驗。24小時後，細胞不均勻地附著在支架上，可見幾個細胞聚集體(紅圈)。72h後細胞均勻分布，7d和10d後支架被hMSCs完全均勻覆蓋。比例尺=2 mm。

10d後進行DAPI-Phalloidin染色。綠色、藍色和紅色通道分別用於顯示細胞骨架、細胞核和支架纖維(圖7)。觀察到細胞橫跨支架的角落，並開始填滿大孔內的空隙。

圖7：轉基因培養10天後的DAPI-Phalloidin染色。照片是用立式立體顯微鏡(奧林巴斯SZX16)在不同放大倍數下使用所有通道採集的，並與ImageJ®合併。紅色通道：支架纖維(由於染料木素的自身螢光)；藍色通道：細胞核；綠色通道：細胞骨架。紅色虛線標出了腳手架。比例尺=500μm。

在接種24小時和14天後，在不需要任何額外染料的情況下，用螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白HUVECs的組織(圖8a)。24小時後，HUVECs是圓形的，沒有連接，就像在水凝膠中種植後所預期的那樣。到了第14天，它們形成了複雜的相互連接的毛細血管樣網絡(圖8b)；實驗條件1和3的網絡之間沒有明顯的質量差異。

圖8：(A)在實驗條件1中種植24小時和14天後骨組織中的HUVECs組織的比較。在24小時內，HUVECs很少，圓形且沒有組織，而在第14天，它們在支架的大孔內和支架纖維上都排列成毛細管狀網絡。(B)以兩種不同的放大倍數放大實驗條件1和3的HUVECs網絡圖像。兩種實驗條件下均可形成毛細管狀網絡，且無質的差異。(A)刻度尺=2毫米，(B)刻度尺=500μm。

H&E染色顯示hMSCs來源的成骨細胞和血管形成的人臍靜脈內皮細胞之間的細胞形態(圖9)。由於納米羥基磷灰石的存在，凝膠-納米羥基磷灰石支架染成了深紫色。然而，這並不能掩蓋骨樣基質的沉積，這種基質染成粉紅色，在所有實驗條件下都清晰可見。此外，HUVECs不僅在支架大孔內形成了毛細血管樣網絡，而且在實驗條件1和3中呈現清晰可識別的管腔(圖9)。在這些情況下，管腔的數量和大小沒有明顯的質量差異。當人臍靜脈內皮細胞不存在時(實驗條件2)，成骨分化的人骨髓間充質幹細胞是唯一存在的細胞。這些細胞仍然靠近支架表面，在填充大孔的水凝膠中看不到管腔。

圖9：在不同放大倍數下所有實驗條件下構建物的H&E染色。骨樣基質在所有實驗條件下均可見(箭頭)。在實驗條件2中，大孔內不存在管狀結構，因為水凝膠中沒有人臍靜脈內皮細胞，只有均勻分布的分化的人骨髓間充質幹細胞。在實驗條件1和3中，支架大孔中可以清楚地看到由人臍靜脈內皮細胞形成的管狀結構和管腔。

CD31免疫組織化學進一步證實了實驗條件1和3中HUVEC管腔的形成(圖10)。實驗條件2作為對照，正如預期的那樣，沒有細胞染色，因為沒有人臍靜脈內皮細胞加入到水凝膠中。

圖10：所有實驗條件下構建物的CD31免疫組織化學。在實驗條件1和3中，支架大孔內的HUVECs染色證實了HUVECs形成管腔。在實驗條件2中，由於未加入人臍靜脈內皮細胞，因此未見染色。

圖11：用實時定量聚合酶鏈式反應分析血管化骨結構的基因表達。報告了所有時間點和實驗條件。*=p值<0.05，**=p值<0.01。

在這項研究中，研究團隊證明了序貫誘導方法能夠在相同的培養空間內實現血管-成骨的結果。首先，他們促進了種植在三維生物列印凝膠-納米羥基磷灰石支架中的hMSCs的成骨。然後，在載人臍靜脈內皮細胞的水凝膠中誘導形成了穩定的血管網絡，填充了支架的大孔。

這一方法產生了一種受生物啟發的體外骨血管模型，模擬了組織發育過程中毛細血管的從頭形態發生。生物列印的體外血管化骨模型可以用來在健康和病理條件下詢問骨生物學，並測試潛在的治療方法。這裡報導的方法代表著朝著創建逐步更真實的模型邁出了重要的一步，該模型可能包括其他類型的細胞，如破骨細胞或骨細胞。

此外，血管化骨性結構的一個自然發展是它與軟骨相結合，創造了一個名副其實的骨軟骨模型，以探索軟骨、骨和血管系統之間發生的複雜的串擾。