微藻培養:基礎生物學到工程技術(1)

2020-12-06 可為漁業

微藻的種類很多自然界中發現的有6萬多種,有記錄的6000多種,常用的幾十種。微藻產品價值鏈非常長,從藻種開始,用什麼樣的微藻,它具有什麼的性質,然後你用什麼的培養方法,用什麼樣的培養技術體系,怎麼樣回收,怎麼樣深加工和高值化等一系列的問題,這些問題的解決來實現微藻產品的價值鏈,通過價值鏈來實現其價值。這些問題都必須要認真思考,回答這些問題首先就是要清楚微藻的基礎生物學。

微藻的基礎生物學是工程化的基礎。如果沒有生物學的理解,透徹認識,工程化也不可能做好。首先就是藻種的性質,藻種的性質主要指它的遺傳特性。藻種具有什麼的性質,能做什麼樣的工作,為什麼樣產業服務,需要什麼樣的培養體系。需要什麼的培養基,如何去培養,這樣一些問題的回答的都必須要了解它的遺傳特性。第二個方面的就是營養方式,營養方式取決於兩個方面,一個是物質,一個是能量。我們吃飯不僅是要提供物質基礎,同時也是在提供能量。

對微藻來說有三個方面,一個人就是化能異養,化能異養是指在有有機物,沒有光的時候通過氧化呼吸作用來產生能量叫化能異養。光能異養是指同樣在有有機物的時候還有光,光可以做能源,這時候的物質還是有機物,能源有兩方面,一方面是光合作用,由光能提供能源,另外一方面依然去氧化有機物,因此光合作用和呼吸作用都能產生能量。在沒有有機物,只有光時,只能靠光合作用產生能量。物質和能量對於微藻是不可缺少的,必須根據有什麼樣的物質採取什麼樣的能量方式,細胞才能正常的生長繁殖。

培養基包括碳、氮、磷及微量元素,從自養的微藻來說,它的培養基主要成分是無機物,如無機碳、無機氮、無機磷及其他元素等。有些微藻可以進行混養生長,也就是光能異養或者化能異養生長,因此其需要有機物,可以利用簡單的有機碳、有機氮等。

培養設施通常是細胞生物反應器,如果有光則稱為光生物反應器,分為兩種情況,一個是完全化能異養的反應容器是發酵罐,發酵罐不僅是金屬罐還是玻璃罐基本上是沒有光,即使加光也是不同形式的加光或者後來發展成光發酵罐,就可以進行光能異養。通常發酵罐要進行滅菌,有培養基流加,供氧及pH值檢測、溶解氧檢測等系統。因此發酵罐的系統是工業程度、工業化、自動化程度最高、最有效的,但是並不是所有的微藻都能夠進行發酵,能進行發酵的微藻是有限的,幾十種。

光能自養的微藻容器是光生物反應器。這時必須要有光源提供能量;還要有碳源,因為碳源沒有有機物進行自養,所以其具有二氧化碳或碳酸氫鹽等自養體系。有發酵罐可以用,但要選好藻種,另外用光生物反應器要考慮是光能自養還是光能混養。如果是光能混養就要一邊給光,一邊給添加有機物。有機物是有機氮還是有機碳等都是要考慮的。因此這個基礎生物學的性質是工程化的基礎。

常見的微藻種類有藍藻、硅藻、綠藻、隱藻、金藻等,這些藻類都具有不同的用途,在水產養殖和做餌料方面、調水劑方面有不同的用途,針對不同的養殖動物對象採取不同的微藻養殖品種,一定要考慮其遺傳特性。一個藻具有什麼樣的遺傳特性,它的營養及生物活性一定是怎麼樣的情況。螺旋藻主要是高蛋白性質,含有少量的脂肪酸,但其特點是GLA含量較高,其他的類胡蘿蔔素、葉綠素等都有,但相對含量較低。與小球藻相比,綠藻的特點是含高蛋白,但是其蛋白質含量比螺旋藻低,色素、類胡蘿蔔素要遠遠高於螺旋藻。

有些綠藻含有EPA,雨生紅球藻含有蝦青素,還有些含有多糖。如果做餌料就單一的飼餵小球藻不管是對動物還是對輪蟲營養強化時,它的脂肪酸種類不齊全,因為它沒有十八碳酸,更長鏈的脂肪酸,這時由其遺傳決定的。硅藻含有大量的EPA,巖藻黃素,昆布多糖等也是由遺傳決定的。金藻含有大量的DHA,像等邊金藻、巴夫藻都有大量的DHA,貝類和魚苗基本都是終身需要金藻和硅藻。就是因為其需要大量的多飽和脂肪酸。而給貝類和對蝦餵大量的小球藻脂肪酸的種類就不齊全。影響其變態發育,不缺蛋白,缺少的是長鏈脂肪酸。所以針對不同的飼餵動物,要求的營養成分不同。但這些營養成分對微藻來說是由遺傳決定的。

微藻的遺傳特性決定營養的特徵,像螺旋藻是免疫強化劑,就是因為藍綠藻含有大量的藻蛋白,其中藻藍蛋白含量較高。紫球藻是海洋的單細胞紅球藻,含有藻蛋白,最大量是藻紅蛋白,這也是遺傳決定的。硅藻巖藻黃素較高,高於海帶的成百上千倍,所以硅藻是生產巖藻黃素最好的品種。但在其他的微藻裡,如金藻中也有個別的巖藻黃素,但其含量較低。

微藻多數都是光自養的,就意味著光合作用,光是地球上所有能量的來源,萬物生長靠太陽,這是一個千古不變的真理,通過陽光的照射給細胞帶來的能量,將二氧化碳同化成碳水化合物,碳水化合物繼續轉化成各種各樣的生化分子。因此微藻的光合作用能夠釋放氧氣,提供充足的氧氣給耗養生物來進行生長繁殖,才帶來了今天地球上豐富的生態系統。因此,它不僅能夠產生氧氣,還能生產生物原料,還能夠做食品、飼料,還能淨化水。微藻在光合作用時主要的能量來源是太陽光。

微藻固碳和固氮的獨特優勢:微藻通過光合作用後,能固定二氧化碳,產生自身的生物質,同時也能夠利用一些小分子有機物,進行異養發酵,這時會釋放出二氧化碳,因此微藻的營養特性包括異養、混養和自養。利用的碳源和能源方式不同,但都是需要能量及氮、磷其他元素。通過細胞的生長利用有機碳或者無機碳轉化成生物質,生物質裡含有油脂、蛋白色素等。生物質可以做各種生產加工的原料,油脂和非油脂可以作為生物原料,非油脂可以做沼氣、食品飼料,甚至藥品。106份的二氧化碳和16份的硝酸鹽加1份磷酸鹽加0.05份的硫酸根和130份的水變成1個分子的生物質,微藻的生物質同時釋放出144個氧氣。因此其光合作用產氧的效率非常高。在設計培養基時,意味著碳足夠多,氮至少是碳的15%,磷可以少於1%,也就是培養基中有豐富的氮、磷,沒有碳的情況下微藻是不會生長的。

如果有大量的碳,沒有氮或者是磷不足,他的生長也受到限制,受到抑制。每噸藻可固定1.83噸二氧化碳,其原理是只要微藻的生物質大量生產,得到的生物質乘以1.83就能固定多少二氧化碳。微藻固碳的本質是讓生物量大量繁殖,只要能長出多少生物量就能固定多少碳。直接實現了碳減排。同時對工農業的廢棄利用它是可以密結合的。比如養殖業的廢水裡面含有大量的氮、磷,但缺碳。用畜禽養殖業的廢水作為培養基,然後補充二氧化碳,微藻就可以生長了。即結合了碳減排,又結合了氮磷的回收利用。有些工業廢水中含有大量的有機物,如發酵工業的廢舊培養基和清洗的水中含有大量的有機物,但是含氮量很少。用太陽光能源時,碳固定的效率最高,但對於氮來說利用有機碳,可以進行異養發酵,可以進行光下的混養,將氮轉化成蛋白質的效率最高。因此光合固碳和光合固氮這兩方面實際上能二氧化碳減排,和氮磷的減排做出直接的貢獻,形成一個完整的產業鏈。

光合作用的本質是產生化學能和還原力。光合能量通過光合膜上的電子傳遞鏈把其轉化成化學能,化學能是ATP。另一方面產生了還原力(NADPH),都可以進入到光合固碳的環境中間去,就是碳固定。固定二氧化碳時消耗了ATP和NADPH,因此在有光輻照的情況下產生了還原力和化學能。另外將產生的還原力和化學能還能固氮。這樣就實現了物質和能量的傳遞。

圖1

圖1是光譜和光質,在平時日常生活中主要是太陽光,太陽光的光譜所看到是全光譜,從紫外光到紅外光是非常均勻的,藍色部分和紅色部分佔大部分,中間還有綠色部分和黃色部分,對於微藻綠色的光是沒有生命活性的,作用較小,但也不能不連續,如果不連續對微藻是不健康的,用太陽光和日光燈的光譜來比,太陽光的光譜又寬又高,而普通的日光燈的光譜是光風較矮,強度較弱,另外藍光部分較低,紅光部分較低,綠光部分會較高。

微藻的光合作用來說效率不高,細胞能長,但是長不好,光的衰減較迅速,LED培藻專用燈和太陽光光譜和普通光的光譜比,光譜遠遠優於普通日光燈,和太陽光較接近。現在有藍光、紅光、白光等,大部分農業用的紅藍燈珠的LED光進行補光,因為高等植物有組織和器官的分化,有開花、結果、長葉子等過程,但是微藻是單細胞的生物,沒有組織器官的分化,因此這種紅藍燈珠的配比實際上是可以調整,但對微藻的必要性不大。只要找到一個全光譜的光源不需要找紅藍燈珠的配比,因為不是高等植物,沒有組織器官的分化。

圖2是從黑暗無光到慢慢增加光強,到一定時,細胞的光合作用和呼吸作用就達到了一個平衡,在沒有光時,細胞主要是進行呼吸,氧化分解細胞內存儲的營養物質,供能,提供物質基礎和能量。隨著光強的增加,光合作用開始發生,達到一定光強時,光合作用與呼吸作用正好能達到平衡,這是稱為補償點。補償點之上光繼續增加,這時細胞以光合作用為主,隨著光強繼續增加,達到p/biomass,再增加光強時,細胞生長達到最大,細胞不會再繼續生長。這時如果繼續增加光強甚至細胞的生長還會被抑制,這個抑制是因為光帶來的,光太強,這時稱為光抑制曲線。p/biomass時就已經達到最大的光生長效率了,繼續增加,細胞會由於光照的強度增加,導致細胞內光氧化,細胞膜的色素被降解,細胞變白,這時細胞死掉,唯一的原因是光太強,這時應注意光強不能太強,所以光強主要根據細胞密度講的,針對光徑所說的,10cm的水深、20cm的水深和50cm的水深在同樣的光強,每個細胞受到的光輻射是完全不同的,細胞的濃度不同,同樣的光強每個細胞受到的光輻射強度也是不一樣的。光合作用最好、效率最高的這段就是從補償點到飽和點之間這段曲線。

在培養微藻的體系中都會用過大棚,室外沒有遮欄時,圖3,光強較強,如果遮上25%的陽光,光強就會降低。如果在大棚溫室中都有遮擋,還會有灰塵的折射和反射,都會使光強降低。也就是說在戶外完全沒有遮攔時,光強是最高的,在溫室中光強最低。這時為了維持最好的光強,至少要考慮的因素有第一是要不要遮光,第二是要不要開補光燈,第三是要不要清理屋頂上的灰塵造成的遮光等。隨著光強的變化溫度也不同,在戶外沒有遮攔時因為通風,溫度最低;在有遮攔的情況下和它差不多;溫室裡的溫度最高,因為空氣流通困難,熱散發不出去,所有的能量來源和熱都是來自於光。因此要考慮其通風設備是否到位。圖4是氧氣的產生濃度和飽和度,在戶外沒有遮攔的情況下產氧最高,在25%遮蔭時的產氧最低。Greenhouse裡是居中的。實際上三者之間的差別不是很大,主要是針對細胞密度進行控制光強。要維持光強足夠又不要產生光抑制,另外產氧的效率及溫度也是必須要考慮的,尤其是通風降溫裝置。攪拌具有傳熱、傳質和散氧的功能,快速攪拌和慢速攪拌的細胞生長效率是不一樣的。攪拌的快,細胞在光照的表面上下穿梭的機會多,同時將產生氧氣散出去的效率提高,不會產生溶解氧濃度過高產生的反饋抑制,同時也儘可能的增加細胞光照的機會。因此快速攪拌通常消耗率高於慢速攪拌。

無機碳源主要是空氣中的二氧化碳,螺旋藻培養基中加的碳源是碳酸氫鈉、小蘇打、碳酸氫鹽。無機碳主要是二氧化碳和碳酸氫鹽。如果不加入碳酸氫鹽,只靠空氣中的二氧化碳是不夠的,空氣中的二氧化碳在空氣中的濃度是0.04%,對微藻培養遠遠不夠,在低二氧化碳濃度下微藻為了生長繁殖,發展出一套二氧化碳濃縮機制,細胞外的二氧化碳濃度低於細胞內的二氧化碳濃度。因此二氧化碳進入細胞內之後通過碳酸脫水黴、碳酸氫鹽進入細胞是滲透型的。

一旦進入細胞的第一個屏障,穿過細胞壁進入細胞的肢體空間內,在細胞膜上就具有專有的運輸載體。把二氧化碳和碳酸氫鹽運進細胞,運輸前進入到細胞前是由碳酸脫水黴來實現的。變成碳酸的形式進入細胞後很快就進入合成代謝中了,尤其是二氧化碳,碳酸氫根在細胞內在某些局部的細胞空間又可以被轉化成碳,二氧化碳又進入光合系統中,合成澱粉、糖原、多糖。細胞發展出一套利用空氣中很稀薄的二氧化碳的濃縮機制,細胞外的二氧化碳雖然只有0.04%,細胞內的二氧化碳遠遠大於細胞外的二氧化碳。這是綠藻的模式。硅藻、金藻和紅藻在二氧化碳濃縮模式略有不同。不同也是由遺傳特性決定的。

pH值在一個體系中進去的是二氧化碳,但實際上很快變成碳酸氫鹽和碳酸鹽。在pH值6.5時,是以二氧化碳的形式為主,但pH值在8.3時,全部轉化為碳酸氫鹽。pH值在9.5以上時,主要都是碳酸鹽。除非個別的極度耐鹼的利用碳酸鹽,大部分微藻都只能利用二氧化碳和碳酸氫鹽作為無機碳。這時補碳注意補到什麼程度,讓它以二氧化碳的形式存在還是以碳酸氫鹽的形式存在。碳酸、碳酸氫根、碳酸根是由於pH值決定了各自的濃度和比例。比如pH值在6.3時,碳酸氫鹽和二氧化碳基本上跟佔50%,pH值在8.3時,只有碳酸氫鹽。

微藻利用的有機碳主要是小分子有機物,異養微藻、混養微藻主要利用的是葡萄糖,葡萄糖是是最高效的有機碳源,除了葡萄糖外,醋酸鹽也可以,有的能利用甘油,還有的能利用蔗糖等分子,小球藻只能利用甘油、葡萄糖、醋酸、蔗糖、甘露糖、半乳糖等,但利用效率不同。利用這些簡單的有機物通過生化反應過程,最終合成油脂、甘油三酯、脂肪酸等成分。通過TC循環,呼吸產生ATP能量物質和中間的一些代謝產物。因此能夠利用有機碳源都可以進行混養和異養。小球藻的混養要大於異養。通常對於不同的微藻有一個基本規律就是混養的生長速率等於自養的生長速率加異養的生長速率。微藻要混養,因為生長快,所需要的條件不苛刻。要求光強不高。培養微藻的環境因素有溫度、光強和鹽度的範圍。硅藻、三角褐指藻和骨條藻等喜歡低溫,金藻、綠藻等能耐高溫。三角褐指藻等的光強為2000-5000lx,綠藻和金藻喜歡強光。螺旋藻最耐高溫最適條件為35~38℃。角毛藻在25℃左右,小球藻在25~28℃,金藻在十幾度。螺旋藻最適的鹽度是16.8g/L,角毛藻28-30g/L,金藻是15-25mg/L等。

培養基的配方:不同培養基的品種可以選擇不同的原料進行搭配,如果能夠異養或者混養進行培養的微藻可以簡單的有機物葡萄糖、蔗糖等碳源來做;如果是自養型,只能利用二氧化碳和碳酸氫鹽。對於氮磷沒有很多的選擇,比如酵母膏、酵母水解物等,最簡單的有機物是尿素,其他的氮都屬於無機氮。鎂非常重要,有些培養基缺鎂,葉綠素的合成不充分,細胞偏黃,補充鎂後顏色偏綠。配硫酸亞鐵和其他微量元素時,建議用酸水來配,酸水是1升的水加1毫升的,酸。這樣不容易氧化。

氮源的種類(C-169),篩選若干種氮源,長得最好的氮源是硝酸鉀,尿素較好。硝酸鉀是無機氮,pH值相對較高,尿素是最簡單的有機氮。碳酸氫銨和氯化銨是最不利於生長的,氯化銨這樣的氮源鹼性離子用掉後剩下的是強酸根,所以pH值一直在下降,如果用硝酸鈉、硝酸鉀這些硝酸根利用後留下的是鈉和鉀,pH值一定會上升。因此選擇氮源也會決定後期pH值的走向。角毛藻的氮源比較時發現碳酸氫銨較好,生物量及細胞密度都較好。油脂的積累也是最好的。pH值變化也較小。碳銨被利用後要補充二氧化碳。補的氮源是氨水。

硅藻具有矽酸鹽的殼,分裂時矽殼分為兩部分。所以在合成矽殼的過程中一定形成矽,用量不能太少,並不是所以的硅藻都需要大量的矽酸鹽在培養基中。有研究表明:三角褐指藻的繁殖過程中不需要太多的矽,有的硅藻矽殼較厚,花紋較多,這時需要大量的矽。

本文來自於範老師大講堂直播間課程,範老師學生整理,講課老師是華南理工大學魏東教授,藉此機會機會感謝教授的辛勤付出。

△內容來源: 範老師微藻物聯世界,作者:魏東,圖片來自網絡,版權歸原作者所有,如有侵權,請聯繫我們刪文

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