近年來，隨著共刺激和共抑制機制的發現，以及免疫檢查點抑制劑在臨床上的巨大成功，腫瘤免疫治療迎來了劃時代的變革。儘管如此，仍然只有 20% 左右的患者和部分腫瘤類型受益，尋找新的免疫療法和聯合治療方法迫在眉睫。
追根溯源，人類歷史上第一款腫瘤免疫療法應屬於 1986 年 FDA（美國食品藥品監督管理局）批准的用於治療 HCL (hairy cell leukemia, 毛細胞白血病)的藥物——IFNα（幹擾素 -α）。一型幹擾素是重要的抗病毒細胞因子，同時也兼具抗腫瘤的效果。自此，細胞因子叩開了腫瘤免疫療法的大門。
隨後，高劑量重組 IL-2（白細胞介素 - 2）分別於 1992 年和 1998 年被 FDA 批准用於治療轉移性腎癌和轉移性黑素瘤。IL-2 作為一款明星抗腫瘤治療手段，其腫瘤整體反應率高達 15% 左右，被賦予厚望，至今仍然在臨床上被廣泛研究和應用。但由於細胞因子的半衰期短、需要長期給藥和嚴重副作用等難以克服的問題，IFNα很快被嘌呤類藥物代替了治療 HCL 一線藥物的地位，而 IL-2 也逐漸被擱置，細胞因子在腫瘤免疫療法上的應用也逐漸淡出了人們的視線。
2020 年 6 月 24 日，一篇發表在 Nature 上的論文：IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy，又將細胞因子療法拉回了大眾的視野。論文指出，利用定向進化等技術將野生型 IL-18（白細胞介素 - 18）改造為 DR-18 (decoy-resistant IL-18)，可以讓其具有不被它的天然抑制劑 --IL-18BP 所抑制且可以繼續轉導信號的功能，在小鼠腫瘤模型中發揮了強大的抗腫瘤作用，也暗示了 IL-18 在腫瘤免疫療法中的潛力。
近日，生輝與此篇論文第一作者耶魯大學周挺博士一起探討了細胞因子在腫瘤免疫療法中的「過去與未來」。
圖 | 耶魯大學周挺博士（受訪者提供）
突破，主要是對靶點的選擇
生輝：為何選擇細胞因子作為抗腫瘤免疫治療手段？
周挺：細胞因子是一個典型的矛盾複合體。它一方面天然的具有抗腫瘤的潛力：細胞因子作為一種小的、可溶性的信號蛋白，調控著免疫細胞及其相關細胞的生長、發育、分化和效應功能，這些功能對於免疫系統和免疫細胞在對抗病原菌入侵和腫瘤的過程中至關重要。但另一方面，細胞因子因其多能性 (pleiotropic)、冗餘性 (redundant)、不同的產生來源 (resource) 和作用終端 (destination)，以及其作用的多種方式 (autocrine, paracrine & endocrine)，編織了一張複雜的細胞因子網絡。同時，細胞因子的高效性讓自然進化了嚴格的負調控機制，大大削弱了其生物學功能。這些因素導致細胞因子治療容易產生各種副反應，藥物耐受度低和高毒性，使得細胞因子又不 「天然」 的適合作為可以利用的藥物靶點。
近年來，利用精確的 「設計」 和改造細胞因子從而去除其不利的生物學特性，為該領域開闢了新的方向。我所使用的起始研究工具，定向進化和酵母展示，正是這個新方向的推手。定向進化和噬菌體（酵母）表面展示技術曾獲得了 2018 年的諾貝爾化學獎，是一項強大的蛋白質工程手段，同時也是一種重要的基礎科學研究工具。通過這個工具，可以把細胞因子改造成只跟某一種受體結合，而不跟其他受體結合，同時結合親和力提升，從而放大它在這個信號通路中的輸出表型，使其與其他信號通路區分開來。這些具有激活特定通路的偏好激動劑（partial agonist）不僅能釐清細胞因子在複雜網絡中的每條信號通路的具體生物學功能，解決 「多能性」 和「冗餘性」等問題，同時也成為了候選藥物。
生輝：在眾多細胞因子中，為何挑中了 IL-18？
周挺：我的導師在他博士期間曾經開發了兩個在概念上有創新突破的細胞因子靶點：CD122 偏好的 IL-2(super-2)用來避開調節型 T 細胞從而特異激活腫瘤殺傷 CD8 T 細胞，以及 SIPRα高親和力突變體用來阻斷巨噬細胞上的 CD47 靶點。但在後續臨床前研究中效果並不突出，因此我們仍然想在這條路上深挖下去。我們在挑選細胞因子時的前提假設是，它必須是特異作用於腫瘤微環境中的，這樣可以避免它非特異性的系統的激活全身免疫細胞而導致高毒性。2016 年哈佛大學 Ana Anderson 和 Vijay Kuchroo 兩個課題組在 cell 上發表了一篇文章，他們利用單細胞測序結束結合新開發的分析方法詳細剖析腫瘤浸潤免疫細胞中重要的基因靶點，我們下載了他們的數據並重新分析了細胞因子靶點的情況，驚奇的發現 IL-18 以及它的兩個受體全部在腫瘤浸潤 CD8 T 細胞中高表達，暗示了 IL-18 對於該類細胞的特異激活潛力。IL-18 作為 IL-1 家族的重要促炎因子，是 NLRP3 炎症小體下遊的重要效應分子。它結合其異源二聚體受體 (IL-18Rα/Rβ) 介導了 MyD88-NFκΒ信號通路。IL-18 的主要功能之一是刺激 NK 細胞和抗原配對過的淋巴細胞產生γ幹擾素。令人驚訝的是，具有如此免疫激活特性的細胞因子，十幾年前它在腫瘤臨床試驗中卻被發現沒有效果，其二期臨床試驗以失敗告終。如此巨大的反差，引起了我們對於 IL-18 的強烈興趣。
生輝：您也提到 IL-18 功能很強大，那為什麼臨床試驗會失敗？
周挺：我們分析了他們發表的臨床試驗研究報告，發現很多指標中有一個叫做 IL-18BP 的蛋白在病人接受 IL-18 注射後，其濃度就會升高 10-100 倍，而且四個星期後仍然穩定存在。這麼高的誘導表達是極為少見的。IL-18BP 是 IL-18 的誘餌受體 (decoy receptor)和天然抑制劑，它以超高親和力 (1.1pM) 結合 IL-18 並阻止其與受體結合。我們通過生物信息學、免疫組化、ELISA 等多種手段確認了 IL-18BP 在人類腫瘤中高表達。同時我們也在小鼠腫瘤模型中做了試驗，在腫瘤的建立過程中以及給小鼠注射 IL-18 後，IL-18BP 蛋白含量顯著增高，驗證了人體中的數據。後續我們使用 IL-18BP 敲除的老鼠進一步證實 IL-18BP 確實對 IL-18 的抗腫瘤效果有強烈的抑制作用。至此，我們確認 IL-18BP 作為一種可溶性的免疫檢查點，而且是 IL-18 免疫治療的主要障礙。
生輝：當你們發現 IL-18BP 有強烈抑制作用時，為什麼不選擇做抗體藥物？
周挺：IL-18BP 蛋白結合 IL-18 的親和力非常高。我們通過 SPR 測量了 IL-18BP 蛋白與 IL-18 的親和力，大概是 1.1pM，這比以前文獻裡報導的 400nM 更加精確。而抗體和抗原的結合親和力大多在 nM 級別，因此 IL-18:IL-18BP 的結合力比抗體: IL-18BP 結合力強三個數量級，因此用抗體來阻斷是很難成功的。所以我們通過定向進化來改造 IL-18，讓它不結合 IL-18BP，只結合它的受體。這樣改造後的 IL-18 能刺激它的受體產生信號去激活免疫細胞，同時又能拮抗 IL-18BP 的功能。我們也將這個改造後的 「IL-18」 命名為 「DR-18」（Decoy-Resistant IL-18），「Decoy-Resistant」 意思就是「不結合抑制劑 IL-18BP」。
生輝：在將 IL-18 改造為 DR-18 的過程中，是否會擔心改造不成功？
周挺：將 IL-18 改造成 「DR-18」 確實很有挑戰。IL-18 和它的受體親和力大概在 10nM，和 IL-18BP 的親和力是 1.1pM，所以 IL-18 對於 IL-18BP 有一萬倍的偏好性。能把這個偏好性去掉，同時還得保留受體的結合能力，單單通過人為點突變的方法是很難實現的，必須通過建立突變體庫來進行篩選。我們首先通過結構生物學的分析，把 IL-18 與 IL-18BP 以及受體的共有的結合面找出來，大約有十幾個位點。我們將每個位點突變成偏向受體結合的幾種胺基酸，十幾個位點便組合成了一個突變體庫。我博士期間是研究蛋白質結構的，所以在蛋白質結構的分析和突變體庫的設計上有一定的經驗，經過導師的一些指點，我們做出了一個非常好的突變體庫，這是成功的第一步。而最終的 「DR-18」 也確實是從這個具有 2.5 億個突變體的庫裡成功篩選出來的。
成藥的關鍵
生輝：您如何看待 DR-18 的安全性問題？
周挺：安全性肯定是藥物研發中重點關注的問題，尤其是細胞因子的主要問題就是毒性太大。IL-18 本身就是一個免疫激活劑，改造後的 DR-18 是更強的激活劑，大家肯定擔心其毒性。但是討論毒性不能不結合劑量，再毒的東西給一點點其傷害可能不太大，毒性不大的東西給太多也會造成損傷。我們在小鼠中做過劑量爬坡實驗，測試過不同的劑量、給藥頻率和日程，發現在有效治療腫瘤的劑量窗口內（0.1～1mg/kg）基本沒有明顯毒性。我們分析了小鼠的肝臟、肺及消化道，幾乎沒有組織異常表現，血相上有些指標在給藥時會有所降低但在停止給藥後也都很快恢復正常。我們在猴子中也做了試驗，觀察到的結果是類似的。當然，這個藥能不能夠成功還得看臨床的結果，腫瘤病人的免疫系統和身體其他機能跟正常人是有差別的，所以毒性問題還需要根據臨床試驗結果來確定。
生輝：DR-18 會和 PD-1 或者 CAR-T 進行聯合治療嗎？
周挺：會的，這是一個很重要的方向。從原理上來說，細胞因子的作用機理和 PD-1 是有互補性的，它們介導的信號通路、引起的免疫反應、激活的細胞類型都不同，所以我們會嘗試組合，進行聯合治療。細胞因子作為效應分子裝進 CAR-T 裡是很常見的設計，目前我們正在和賓州大學兩個團隊進行相關合作。當然我們主要還是會嘗試單藥，從實驗數據看單藥效果是很好的。
生輝：您認為這次對細胞因子療法的研究突破是什麼？
周挺：突破主要是對靶點的選擇和改造。因為細胞因子治療雖然從 80 年代就開始，但從一型幹擾素和 IL-2 之後，FDA 就再也沒有批准新藥。目前研究細胞因子治療主要是兩大類：一類是，把已經批准的兩款藥與其他放療化療藥聯用；另一類是新修飾和融合蛋白藥，圍繞 IL-2、IL-10 和 IL-15 三個靶點，譬如 Nektar 公司的聚乙二醇交聯 IL-2 (NKTR-214)、禮來公司 (收購 ARMO) 的聚乙二醇交聯 IL-10 (Pegilodecakin)，以及 Altor 的 IL-15/IL-15Rα/IgG1 Fc 融合蛋白(ALT-803)，但臨床結果有好有壞，還需要更長的時間觀察。IL-18 可以說是一個全新的靶點。雖然十年前 GSK 圍繞它做臨床試驗，但是失敗了，之後就沒有人再繼續研究。我們這次明確了 IL-18BP 作為 IL-18 治療的障礙，並通過生物學功能的改造重塑了它的應用前景。
生輝：DR-18 會有半衰期短的問題嗎？
周挺：作為小的細胞因子蛋白，半衰期是短，但這不是問題。DR-18 的半衰期只有兩個多小時，但這已經激起了足夠多的免疫效應。我們曾經嘗試過 DR-18 和 Fc、HSA 等融合設計，但增加了半衰期並沒有增加藥效，所以我們最終決定放棄。我們還對比過靜脈給藥和皮下注射等不同給藥手段，皮下雖然其 Cmax（the peak serum level，血清最高水平）比較低，但是具有更大的 AUC（the Area Under the serum concentration time Curve，血清濃度時間曲線下的面積）。另外，我們認為在試驗中沒有觀察到明顯的 DR-18 的毒性，可能也與半衰期短有關，所以我們決定最終藥物製劑就用 DR-18 蛋白。
生輝：DR-18 會是一次性給藥，還是像幹擾素一樣需要長期給藥？
周挺：DR-18 和幹擾素是不同的。幹擾素長期給藥的原因是毒性較大，不能一次性給足劑量，只能分批給藥。而在我們臨床前試驗結果顯示，在小鼠身上一周只需打兩次 DR-18（0.32mg/kg），就足夠讓 60%-80% 的腫瘤消失。在猴子身上一周也只需要打兩次，甚至有些情況下一周打一次，就已經觀察到足夠的藥效。所以 DR-18 理論上來說不需要多次給藥，當然具體的臨床實驗給藥劑量、日程、頻率等問題還得靠有經驗的臨床人員去決定。
尋找，有趣的事兒
生輝：可以簡單介紹一下您的科研經歷嗎？
周挺：我這個人一直都不太滿足於自己的現狀，一直想挑戰自己，所以到目前為止整個科研訓練都是一個內心上追尋的歷程，尋找一個自己擅長做的，喜歡做的，且有意義的交匯點。我在中國農業大學讀本科時，我研究的是作物遺傳學方向。接著去中科院生物物理所讀研時，比較著迷於蛋白質結構。這也是我科研訓練裡面最長的一段經歷，那時常苦惱於自己在蛋白質方面積累的經驗在以後沒有用武之地，沒想到冥冥之中卻成了我第二站博後以及整個科研生涯的一個主推力。2014 年博士畢業來到耶魯大學分子細胞發育生物學系做第一站博後，本想從蛋白質換換口味到研究核酸（RNA）的結構與功能，但事與願違。草草兩年結束之後，在王俊師兄牽線下，2016 年加入了耶魯免疫系我現在的導師實驗室，研究細胞因子在腫瘤免疫上的功能。在這裡，我以前的訓練背景、自己的興趣愛好和重要的科學問題等都很好地結合在了一起。
生輝：第二站博後經歷裡哪些因素比較重要？
周挺：我可以從三個方面說一下，大環境、微環境和人。大環境是耶魯免疫系的大環境。作為全美排名第一的免疫系，雖有那些如雷貫耳的 big name，但我認為最重要的是整個系自建系以來歷經各代宗師所養成的精神氣質，一種純粹和極致的追求重要科學問題的面貌，一種毫無保留無私分享和交流合作的氛圍，一種尊重每個個體和全方位培養 trainee 的態度（個別除外）。微環境就是我所在的實驗室，導師年輕有活力，組裡其他研究生都是絕頂聰明，博後都是高效高產。影響我的人太多，把我 「拐」 進免疫系的王俊師兄（現為紐約大學助理教授）「首當其衝」，從來沒摸過老鼠的我起步就是他教的，後續他在我課題上的幫助、對於很多科學問題的見解以及他對研究的專注程度，對我影響頗深。我身邊還有一群經常深入討論的大牛博後朋友們，譬如先天免疫專家周旭博士（現為哈佛大學助理教授），心血管研究專家陶波博士，細胞生物學專家鄧永強博士（現為南方醫科大學教授），超分辨硬體專家章永登博士（現為西湖大學助理教授），Rag2 專家張宇航博士等，每次與他們的深入討論都讓我受益匪淺。還有不得不提的是免疫系和其他系聰明絕頂的研究生朋友們，這些高濃度存在的「非人類」，經常讓我陷入「絕望」，但也時刻激勵著我前進。
生輝：您是否有回國計劃？
周挺：我目前打算回國建立實驗室，繼續以細胞因子為切入點，去研究免疫過度抑制（腫瘤）和過度激活（炎症疾病）的機制。我覺得細胞因子是抗腫瘤的重要一環，細胞因子激動劑是一個很好的方向，只是沉寂的太久了。之所以沉寂，是因為 「多能性」 等問題一直很難解決，而定向進化和酵母展示技術，就是天生解決這個問題的利器。在腫瘤、自身免疫病和炎症疾病的治療上，我認為細胞因子「大有可為」！