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2020年10月22日，美國加州Scripps研究所吳鵬團隊在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上發表了一篇新研究，題為"Detecting Tumor Antigen-Specific T Cells via Interaction-Dependent Fucosyl-Biotinylation"，研究組介紹了FucoID，即一種可檢測內源性抗原特異性T細胞的通用平臺，可用於研究其生物學過程及功能。FucoID具有無基因操縱程序、周轉循環快速的特點，應具有加速個性化癌症治療步伐的潛力。
Cell Press細胞出版社微信公眾號對該論文作者進行了深度採訪，並邀請北京大學陳興教授做了點評，旨在與廣大科研人員深入分享該研究成果以及一些未來的展望，點擊「閱讀原文」或識別下圖二維碼閱讀英文原文。
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摘要
腫瘤特異性抗原（TSA）反應性T細胞的重新激活和克隆擴增對於檢查點阻斷和腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）過繼轉移療法的成功至關重要。由於它們的異質性組成，沒有可靠的標記物可以特異性鑑定TSA反應性T細胞的全部構成。我們在此介紹FucoID，這是一種可檢測內源性抗原特異性T細胞的通用平臺，可用於研究其生物學過程及功能。通過這種依賴性相互作用的標記方法，可以檢測到腫瘤內TSA反應性CD4+、CD8+ T細胞，以及TSA抑制性CD4+ T細胞。根據旁觀者T細胞的細胞表面酶促巖藻糖基生物素化作用，可將這些細胞從旁觀者T細胞中分離出來。與旁觀者TIL相比，TSA反應性TIL具有獨特的T細胞受體（TCR）庫和獨特的基因特徵。TSA反應性CD8+ TILs雖然表現出功能障礙的表型，但具有很強的增殖和腫瘤特異性殺傷能力。FucoID具有無基因操縱程序、周轉循環快速的特點，應具有加速個性化癌症治療步伐的潛力。
作者專訪
Cell Press細胞出版社特別邀請論文通訊作者吳鵬副教授代表團隊進行了專訪，請他為大家進一步詳細解讀。
CellPress：
先請簡單介紹一下您團隊的這項研究。
吳鵬副教授：
如何精確和經濟有效的分離腫瘤特異性抗原反應性腫瘤浸潤T細胞（TSA-reactive T cells）是使用過繼性細胞轉移治療癌症的主要挑戰。基於腫瘤特異性抗原反應性T細胞與樹突狀細胞的抗原特異性相互作用，我們開發了一種化學生物學方法，稱為FucoID，用於快速探測和分離這些T細胞亞群。我們使用這項技術從多個鼠類腫瘤模型中分離出腫瘤特異性抗原反應性腫瘤浸潤CD8+ T細胞，並發現該T細胞亞群具有獨特的TCR組成，類固醇生物合成上調並在體外和體內均表現出強大的腫瘤反應性。我們還從Pan02胰腺腫瘤中分離了TSA特異性CD4+ T 細胞，並發現腫瘤抗原反應性和抑制性CD4+ T細胞共存於腫瘤微環境中。
CellPress：
瘤內旁觀者T細胞可分為兩種不同的類型。每一種T細胞類型有什麼特徵？
吳鵬副教授：
我們的技術確定了腫瘤浸潤淋巴細胞中一個腫瘤特異性抗原反應性的PD-1+ Bio+ CD8+和兩個「旁觀者」T細胞亞群：PD-1–和PD-1+Bio–。儘管他們都是「旁觀者」T細胞，這兩組之間存在明顯的差異。在在轉錄組水平上，PD-1 + Bio–細胞顯示出耗竭T細胞的特徵，PD-1–群體顯示出幼稚T細胞的特徵。表型水平上，PD-1–群體含有較高比例的Tim3–TCF1 + T細胞，並且具有比PD-1 + Bio–細胞更高的增殖潛力，儘管這兩個亞群的腫瘤反應性都很低。
CellPress：
TSA反應性TILs與旁觀者TILs有什麼不同？這種不同對其獨特功能有什麼影響？
吳鵬副教授：
T細胞的反應性由其相應的T細胞受體(TCR)決定。我們的TCR分析表明，與旁觀者T細胞相比，腫瘤特異性抗原反應性T細胞具有獨特的TCR組成。在E0771三陰性乳腺癌和MC38結腸癌模型中，這兩種細胞亞群之間前10個最豐富的TCR-CDR3沒有重疊。此外，TSA反應性T細胞具有相對單一的TCR組成，表明這些細胞已經經歷了由腫瘤特異性抗原刺激引起的大量克隆擴增。
CellPress：
TSA抑制性和TSA反應性CD4 + T細胞共存於腫瘤微環境中。它們發揮了怎樣不同的作用？
吳鵬副教授：
我們認為，腫瘤特異性抗原反應性CD4+ T細胞對於控制腫瘤至關重要。它與腫瘤特異性抗原反應性CD8+ T細胞在腫瘤微環境中共存，並在腫瘤抗原刺激下表現出協同的腫瘤控制功能。相反，腫瘤特異性抗原抑制性CD4 + T細胞主要由CD4+ FOXP3+ CD25+ Treg細胞組成，將在腫瘤抗原刺激後抑制CD8+ T細胞的功能。
CellPress：
在包括天然成分和複雜成分的細胞混合物，FucoID如何實現抗原特異性標記？
吳鵬副教授：
FucoID方法的關鍵點是幽門螺桿菌a（1,3）巖藻糖基轉移酶（FT）。這種酶在2009年被吳鵬教授的課題組發現。它有著高Km（對於受體底物LacNAc）（1.3 mM）和高kcat（442 min-1）。我們用FT-功能化的樹突狀細胞與腫瘤單細胞懸液（其含有腫瘤特異性抗原反應性T細胞，旁觀者細胞，腫瘤細胞以及其他種類細胞）共培養。在沒有抗原特異性相互作用的情況下，FT附近的LacNAc（sLacNAc）受體的濃度遠低於FT-LacNAc Km。在這種情況下，雙分子反應速率受kcat / Km（對於LacNAc）控制。由於FT有較高的Km（對於受體LacNAc），背景標記可以被最小化。當樹突狀細胞和腫瘤抗原反應性 T細胞相互作用時，FT附近的LacNAc（sLacNAc）的局部濃度很高，因此假零級反應速率由kcat決定。通過具有高kcat，在真正的細胞-細胞相互作用期間發生的標記信號會被最大化。
CellPress：
為什麼探究iDC與CD4 +細胞的相互作用，尤其是較弱的相互作用很重要？
吳鵬副教授：
CD4 +腫瘤浸潤淋巴細胞對於塑造腫瘤的免疫環境至關重要。一些CD4 + T細胞支持CD8+ T細胞的「健康」功能，而某些CD4+ T細胞被證明具有免疫抑制作用。因此，研究腫瘤抗原特異性CD4 + T細胞的複雜功能非常重要。為此，我們需要使用DC-CD4+相互作用（一種至關重要的抗原呈遞過程）來鑑定該群CD4+ T 細胞，並分析其功能。
CellPress：
FucoID在臨床環境中如何有益於個性化癌症治療？
吳鵬副教授：
目前，人們可以依靠細胞表面蛋白標記物來大致富集腫瘤抗原反應性T細胞。另一種方法，依靠計算機工具和人類基因外顯子測序篩選腫瘤新抗原需要花費大量的時間和高昂的費用。相比較於依賴於生物信息技術的腫瘤特異性抗原鑑定，FucoID具有操作簡單和更快的周期。這個技術不需要修改基因，為鑑定和操作整個內源性腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞提供了新的途徑。我們希望FucoID將大大加快從患者腫瘤樣本中鑑定腫瘤抗原反應性T細胞的過程。在體外擴增後，結合細胞因子和免疫檢查點療法，這些與T細胞將重新注入癌症患者體內，以期達到更好的治療效果。同樣，我們的方法提供了一種快速鑑定抗原特異性TCR的方法，以構建用於個性化治療的TCR-T細胞。我們相信FucoID將在腫瘤研究之外的領域有著廣泛的應用，比如研究抗原特異性T細胞在病毒感染和自免疫疾病中的功能。
通訊作者簡介
吳鵬
副教授
吳鵬博士，美國加州Scripps研究所分子醫學系副教授。在加入TSRI之前，吳博士是紐約愛因斯坦醫學院生物化學副教授和化學生物學中心平臺總監。吳博士2005年 Scripps研究所取得化學博士學位，師從2001年諾貝爾化學獎得主K. Barry Sharpless教授。2005年至2008年，吳鵬博士在加州大學伯克利分校 (UC Berkeley) 美國科學院院士, 霍德華休斯研究會 (HHMI) 研究員Carolyn R. Bertozzi教授實驗室從事博士後研究工作。他將自己感興趣的生物正交化學和生物技術結合，開發了一種用基因編碼的醛基標籤對單克隆抗體進行位點特異性修飾的方法。SMARTag™ technology 四個發明者之一。2014年該專利被Catalent Biologics收購。吳鵬博士從事化學和生物學交叉領域的研究。目前聚焦於開發新工具用於研究蛋白質糖基化，特別是與腫瘤相關的蛋白質糖基化, T細胞活化與衰竭過程中糖基化的變化，以及如何編輯糖基化來提高T細胞抗腫瘤與抗感染活性。
▌特邀評論：
「在腫瘤中存在的腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）在過繼細胞療法（Adoptive Cell Transfer, ACT）等腫瘤免疫治療中具有重要的應用。ACT的關鍵步驟之一是在TILs中選擇性分離出腫瘤特異抗原（Tumor Specific Antigen, TSA）反應性T細胞（TSA-T細胞），因為TILs中的旁觀者T細胞（Bystander T Cells）不具備治療功能，並且會影響TSA-T細胞的培養與擴增。吳鵬團隊為這一重要的技術挑戰提供了一種巧妙的解決方案。他們將一種巖藻糖轉移酶（Fucosyltransferase, FucT）通過自催化的方式，連接到呈遞了腫瘤特異抗原的樹枝狀細胞（Dentritic Cells, DCs）表面。DC細胞表面的FucT可以將與DC細胞相互作用的TSA- T細胞標記上生物素，從而進行表徵與分離。
將FucT開發為一種細胞鄰近標記的方法，是非常聰明的想法。吳鵬團隊中的李劼博士發現FucT對糖基供體上的化學修飾具有很高的兼容性，可以轉移生物素甚至是蛋白質到細胞表面普遍存在的一種二糖之上。這是這個工作的核心技術基礎。
毋庸置疑，這個方法為分離TSA-T細胞提供了一個非常簡便、經濟的方法。從這個工作展現的結果來看，在小鼠腫瘤模型中可以非常快速和高效地得到TSA-T細胞，這將極大地推動我們對TSA-T細胞的進一步深入研究。同時，這個技術具有很好的臨床應用前景。」
評論員簡介
陳興
教授
陳興博士現任北京大學化學與分子工程學院教授及院長。他於2002年獲得了清華大學化學學士學位。在Carolyn Bertozzi教授和Alex Zettl教授的指導下，他於2007年在加州大學伯克利分校獲得化學博士學位。之後，他作為LSRF博士後研究員加入了哈佛醫學院Timothy Springer教授的實驗室，其研究重點是結構生物學和免疫學。2010年9月，陳興博士開始擔任北京大學化學學院的助理教授。2016年，他被直接晉升為教授。他還任職於北大-清華生命科學中心（CLS）以及北京大學合成與功能生物分子中心（SFBC）。他目前的研究興趣集中在化學糖生物學上，其團隊致力於開發能闡明糖基化生物學功能的化學工具，重點關注糖基化動力學的體內標記物、可視化及分析。他對探索糖基化在代謝穩態和大腦病理生理中的功能作用特別感興趣。他所參與的許多研究使用了跨學科的方法，為解決與人類健康和疾病相關的重要問題作出了貢獻。
相關論文信息
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▌論文標題：
Detecting Tumor Antigen-Specific T Cells via Interaction-Dependent Fucosyl-Biotinylation
▌論文網址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31245-9
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.048
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