點評 | 張鵬（哈佛醫學院）、杭賽宇（哈佛醫學院）
撰文 | 陳文強(哈佛醫學院博士後)
責編 | 兮
動物與包括微生物在內的多種生物體存在互惠共生關係。多種細菌能產生具有生物活性的神經遞質，進而調控宿主的神經系統活動性及行為。因此，越來越多的研究者關注腸道菌如何釋放信號影響大腦活動性。
腦腸軸這一新興領域旨在揭示介導腸道定植菌和宿主神經系統的化學信號，並研究其生理學功能。這一領域的進展層出不窮，而大部分重要進展都是在小鼠這一模式動物上獲得，對於線蟲的研究較少。
2020年6月17日，來自美國麻州布蘭迪斯大學(Brandeis University)的Piali Sengupta實驗室的研究人員在Nature雜誌在線發表題為A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behavior的研究論文。
通過使用秀麗線蟲為模式生物，揭示了由共生菌在腸道生成的神經遞質酪胺如何調控宿主感覺決定行為的機制。
首先，為揭示腸道菌影響宿主行為的方式，研究人員使用非致病菌株進行篩選。這類細菌通常能影響野生型線蟲的嗅覺反應【1】。成年線蟲與這些菌株共培養時，能對具有吸引性的揮發性物質表現出強烈的吸引，稱為驅化現象(chemotaxis，圖1，)。
圖1. 使用線蟲進行群體驅化作用試驗
基於此，研究人員使用不同菌株與線蟲進行培養，發現普羅維登斯菌JUb39菌株能顯著降低線蟲對厭惡性物質辛醇的迴避行為。因此，研究人員認為普羅維登斯菌可調控線蟲的辛醇厭惡行為 (圖2)。
而此前研究已揭示，JUb39菌株為支持線蟲生長的有益菌株，並不會產生厭惡反應，即餵食該菌不可能產生營養剝奪【1】。
隨後，使用螢光報告基因系統檢測線蟲的攝食狀態也排除了這一可能性。因此普羅維登斯菌產生的辛醇迴避行為與攝食狀態無關。
圖2. 普羅維登斯菌可調控線蟲的辛醇迴避行為
那麼，線蟲的腸道定植菌如何驅動辛醇迴避行為呢？研究人員將紅色螢光蛋白mCherry表達入OP50及JUb39菌株，發現攝入JUb39菌株後，線蟲腸道內大量杆狀細胞表達有mCherry，提示在線蟲腸道內，JUb39菌株仍可以存活(圖3)。
餵食JUb39的線蟲未表現出病原菌感染，且生存期和餵食OP50菌株的線蟲近似，即提示JUb39對線蟲而言無致病性。進一步的驅化行為試驗揭示JUb39的定植程度與線蟲對辛醇的迴避行為正相關(圖3)。
圖3. 普羅維登斯菌無致病性，其定植程度與辛醇迴避行為正相關
研究人員進而研究普羅維登斯菌調控辛醇迴避行為的機制。此前研究已揭示，驅化行為受多種生物胺及神經肽調控【2】，這些生物胺包括酪胺(tyramine)及章胺(octopamine)，其中章胺是多種無脊椎動物的主要神經遞質。研究人員首先關注的是酪胺代謝途徑。
線蟲體內的酪胺為酪氨酸通過酪氨酸脫羧酶(TDC)催化生成，編碼該酶的線蟲基因為tdc-1。酪胺隨後通過酪胺β-羥化酶轉化成章胺，編碼酪胺β-羥化酶的線蟲基因為tbh-1(圖4a)。
因此，研究人員自然而然地想到使用tdc-1和tbh-1的突變線蟲進行試驗。有趣的是，tdc-1突變線蟲在餵食JUb39後未見有辛醇迴避行為改變，而thb-1突變線蟲表現出該行為的顯著降低(圖4b)。
此外，包括多巴胺及5-羥色胺在內的其他神經遞質的合成酶的突變線蟲均未見辛醇迴避行為的改變。這些結果提示，線蟲生成的章胺 (而非酪胺) 可通過JUb39菌株而調控辛醇迴避行為。
進一步的短程急性迴避行為試驗SOS揭示，普羅維登斯菌產生的酪胺可補充宿主源的酪胺缺失，從而驅動行為決策。
圖4. 線蟲體內酪胺及章胺的生物合成途徑
為研究普羅維登斯菌如何補償tdc-1突變線蟲的酪胺缺失，研究人員使用HPLC-MS進行代謝組學分析。tdc-1突變線蟲餵食OP50後缺乏N-琥珀醯酪胺，而5-羥色胺代謝不變，而在餵食JUb39菌株後酪胺來源的代謝物均恢復正常。因此，JUb39菌株能產生酪胺以補償內源性酪胺的生成不足。
真核生物及細菌內的生物胺主要由芳香族胺基酸及L-穀氨酸通過芳香酸脫羧酶(AADCs) 生成。
革蘭陽性菌腸球菌和乳酸菌的酪胺生成主要是通過位於操縱子的兩個基因tyrDC和tyrP介導的，分別編碼AADC TyrDC和酪氨酸通透酶。普羅維登斯菌為革蘭陰性菌，其JUb39菌株的操縱子也存在tyrDC及tyrP。
研究人員隨後使用乳酸菌TyrDC的晶體結構，通過蛋白質建模，確定了JUb39的TyrDC具有與大多數乳酸菌TyrDC一樣的催化位點，並推測JUb39 TyrDC可由酪氨酸生成酪胺。
通過比較其他菌株，研究人員鑑定出普羅維登斯菌的兩個芳香酸脫羧酶具有生成酪胺的潛在可能。通過敲除JUb39菌株的tyrDC和adcA片段，研究人員發現雙敲除突變細菌的辛醇迴避行為完全喪失(圖5)。
這一結果提示普羅維登斯菌通過芳香酸脫羧酶生成的酪胺可調控線蟲的辛醇迴避行為。
圖5. 同時敲除JUb39菌株的tyrDC和adcA後線蟲辛醇迴避行為喪失
普羅維登斯菌在宿主介導的辛醇調控行為有哪些分子靶標呢？線蟲感受辛醇的神經元主要是雙側ASH傷害感受性神經元【2-3】。這類神經元表達多個酪胺及章胺受體，因此可接受單胺的辛醇調控。
研究人員發現octr-1而非ser-3突變可完全去除JUb39介導的辛醇迴避行為，而在ASH神經元內重新表達octr-1互補DNA可完全恢復這一迴避行為(圖6)。這些結果均證實，OCTR-1是普羅維登斯菌調控線蟲辛醇迴避行為的分子靶點。
圖6. 普羅維登斯菌調控線蟲的辛醇迴避行為需ASH感受神經元內的OCTR1受體
普羅維登斯菌降低線蟲的辛醇驅化行為具有什麼樣的生物學意義呢？有許多革蘭陰性菌可產生辛醇【4】，而普羅維登斯菌是否能產生這一長鏈醇還不清楚。
食物偏好試驗表明，生長於JUb39的線蟲更偏好JUb39，這一偏好在雙敲除tyrDC和adcA片段的JUb39菌株中消除，在octr-1和tbh-1突變的線蟲中也未觀察到這一偏好(圖7)。這一證據強烈地提示細菌生成的酪胺與宿主的章胺通路能調控食物偏好。
圖7. 通過JUb39菌株生長的線蟲在食物偏好試驗中更偏向於JUb39一側
綜上所述，本文通過線蟲這一簡單的傳統模式生物，使用一系列遺傳突變技術及代謝組學分析，揭示了普羅維登斯菌JUb39菌株可在線蟲腸道內生成酪胺，通過宿主章胺及ASH神經元上的OCTR-1章胺受體來調控辛醇迴避行為，進而可改變食物偏好。
圖8為本文提示的模型。結合此前在其他生物體發現的多種腸道共生菌代謝物對攝食行為的效應，本文的結果進一步提示了腸道菌如何生成代謝物 (如本文的神經遞質) 來影響宿主功能及行為。
圖8. JUb菌株在線蟲腸道代謝物調控辛醇迴避行為的模型
專家點評
張鵬
（哈佛醫學院博士後，主要研究線蟲蛋白質降解穩態與壽命之間的關係。博士期間在中國科學院生物物理研究所主要研究方向為線蟲脂滴與脂代謝。）
秀麗隱杆線蟲，作為一個十分優秀的模式動物，以其簡單的優勢，成為整個生命科學研究中的寵兒。 生命科學領域無數重大發現，包括細胞凋亡、RNA幹擾、綠色螢光蛋白等耳熟能詳的諾貝爾獎級發現都是源於線蟲的研究。
線蟲全身一共大約1000個細胞，其中302個為神經細胞。並且這302個神經細胞之間的關係網絡早已繪製完成，使其成為研究腦科學的不二之選。另外線蟲可以以單一的細菌為食物，這一點在關係及其複雜的腸道菌群研究領域，也簡直是救場一般的存在。
Michael P. O』Donnell等人就非常完美的運用了線蟲的這些優勢。 他們通過比較餵食兩種不同的細菌，導致線蟲行為產生的差異，逐步為我們揭示了其複雜的內在分子機制。「趨利避害，亦復均也」，線蟲也和我們一樣，有著趨利避害的本能。當給與刺激性化學物質辛醇時，線蟲會產生迴避行為。
而O』Donnell他們發現當給線蟲餵食JUb39菌株時，線蟲的迴避行為明顯降低，好像線蟲的「鼻子」對刺激性氣味聞而不見。那麼，兩種細菌有哪些不同就成為解釋線蟲「鼻子」開關的重要證據了。
通過一系列試驗，包括比對兩種細菌的基因組和吃完這兩種細菌後線蟲代謝組， 發現是由JUb39菌株產生的酪胺在線蟲體內代謝成其下遊產物章胺，來調控線蟲嗅覺神經元ASH中的章胺受體OCTR-1來實現調節線蟲的迴避行為。
O』Donnell等人的研究，通過觀察線蟲進食不同細菌後的行為，非常詳實的解釋了「腦腸軸」這一概念。由原來的 「You are what you eat」 變成 「You behave what you eat」。這一概念將會為腸道微生物研究領域的提供重要方向。
杭賽宇（哈佛醫學院博士後）
杭賽宇博士 ，目前為哈佛醫學院免疫學系博士後，主要研究腸道菌如何調控天然免疫，師從於哈佛醫學院免疫系Jun Huh博士。
腸道菌如何調節宿主功能一直以來都是令人振奮的研究領域，這不僅是因為細菌類型具有多樣性，且細菌在宿主體內能產生豐富多彩的代謝產物，作用於多種多樣的宿主細胞，從而整合產生具有生理學意義的功能。
正是因為細菌類型的多樣性，尋找具有特定生物學功能的細菌及其代謝物具有一定的挑戰性。大部分關於腸道菌調節宿主功能的研究均以小鼠為模式動物，使用無菌條件或餵食特定細菌。
本文通過改變線蟲這一經典的模式生物的培養基來挑選具有特定調控機制的細菌類型，從而篩選細菌代謝物進行下遊機制研究。縱觀各種小鼠上的腸道代謝物研究思路，這一通過低等動物線蟲的篩選策略簡單易行，具有一定的優勢。
製版人：十一
參考文獻
1. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M.-A. & Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.Proc. Natl Acad. Sci. USA113, E3941–E3949 (2016).
2. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M. & Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.Proc. Natl Acad. Sci. USA101, 15512–15517 (2004).
3. Mills, H. et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans.EMBO J.31, 667–678 (2012).
4. Elgaali, H. et al. Comparison of long-chain alcohols and other volatile compounds emitted from food-borne and related Gram positive and Gram negative bacteria.J. Basic Microbiol.42, 373–380 (2002).