科研成果 | 李海濤/李祥組合作開發AF9 YEATS結構域首個高選擇性環肽抑制劑

組蛋白翻譯後修飾是表觀遺傳調控的重要機制之一，通常其受到「書寫器」（「Writer」）和「擦除器」（「Eraser」）的嚴密調節，並且通過招募「閱讀器」（「Reader」）效應蛋白來調控染色質結構及相關基因表達，從而影響DNA複製、細胞分裂、分化和凋亡等關鍵的細胞進程。越來越多證據表明，組蛋白修飾水平的失調以及識別的紊亂可能是一些人類疾病（如癌症）的重要發病原因之一，這也使得組蛋白修飾相關蛋白成為近年來表觀遺傳學藥物研發的熱門靶點之一。

YEATS結構域是2014年由清華大學結構生物學高精尖創新中心李海濤課題組和美國MD安德森癌症中心石曉冰課題組鑑定出的新型組蛋白乙醯化「閱讀器」【1】，近年來又被發現可以更強的親和力識別組蛋白巴豆醯化（Kcr）並調控相關基因表達【2-5】。除此之外，李海濤組新近報導了YEATS結構域能夠識別組蛋白苯甲醯化修飾的分子機制【6】。越來越多研究表明，YEATS結構域能夠響應機體代謝環境，通過識別相應的組蛋白醯基化修飾類型以調控不同的生物學過程，與經典的組蛋白乙醯化閱讀器——溴域（Bromodomain）有著顯著不同。李海濤課題組、美國David Allis課題組及MD安德森癌症中心石曉冰課題組之前報導了ENL YEATS結構域導致白血病發生【7】，以及ENL YEATS結構域突變導致Wilms』 tumor發生的機理【8】。因此，YEATS結構域是繼Bromodomain之後又一類關鍵的新型表觀遺傳藥物靶點。

人類基因組共編碼4種含有YEATS結構域的蛋白，分別是ENL、AF9、YEATS2和GAS41，其中ENL和AF9的YEATS結構域具有很高的序列相似性【9】。此前，李海濤團隊和香港大學化學系李祥課題組曾於2018年在Nature Chemical Biology上首次報導了一類靶向AF9和ENL YEATS結構域的高效、特異性抑制劑【10】，其中兩個最高效的五肽抑制劑XL-07i和XL-13a的活性達到了亞微摩爾級別（IC50分別為AF9：0.26 μM和0.24 μM；ENL：1.30 μM和0.71 μM）。但是由於AF9和ENL的YEATS結構域非常相似，兩款五肽抑制劑只表現出3-5倍的選擇性，而AF9和ENL在後續的基因調控活動中又發揮著不同的作用【11】，為此亟需開發一款具有高選擇性的抑制劑以表徵這兩種蛋白在後續調控活動中扮演的不同角色。

2020年12月11日，JACS（Journal of American Chemical Society）在線發表了李海濤課題組與李祥課題組最新合作研究成果：「Selective Targeting of AF9 YEATS Domain by Cyclopeptide Inhibitors with Preorganized Conformation」，報導了首個針對AF9 YEATS結構域具備高達38倍選擇性（相對ENL YEATS結構域）的環肽抑制劑，首次實現了在細胞內特異靶向內源AF9蛋白（而該抑制劑對ENL沒有影響），為進一步探究二者功能異同提供了有力的研究工具，為YEATS結構域抑制劑開發提供了新的思路。

本研究在此前工作的基礎上，作者通過仔細對比AF9 YEATS結構域與五肽抑制劑XL-07i複合物的晶體結構和ENL YEATS結構域與組蛋白H3K27cr多肽複合物的晶體結構，發現AF9和ENL YEATS結構域雖然在賴氨酸醯基結合口袋處具有很高的序列結構一致性，但是在Loop 8區域表現出了一定的不同特性。五肽抑制劑中的Cbz基團會與AF9 Loop 8中的兩個組氨酸（H107和H111）形成π堆積結構從而增強相互作用，而相對應的位置在ENL中則是兩個天冬醯胺（N107和N111），不僅無法與Cbz基團形成π堆積結構，且與Cbz基團之間存在嚴重的空間位阻。與AF9相比，Loop 8在ENL中會形成更多的分子內氫鍵，導致整個結構具有更大的剛性，從而不易接受外來的配體分子。這些結構上的發現預示著Loop 8區域將會是實現抑制劑高選擇性的關鍵點。同時值得注意的是，在AF9 YEATS與XL-07i複合物的晶體結構中，為了形成更好的相互作用，XL-07i採取了一種扭曲的構象用以在相鄰的精氨酸以及穀氨醯胺末端形成一個分子內氫鍵。由此，作者大膽推測若是用共價鍵取代分子內氫鍵以形成一個環肽分子，將會形成一個受蛋白結合偏好的提前穩定的構象，為此作者根據此結構特徵設計併合成出了一系列環肽抑制劑，並利用自己開發的一種競爭性光交聯實驗方法對這些環肽進行檢測，其中活性最好的JYX-3表現出了0.41 μM的活性，雖然與此前的線性抑制劑（0.24 μM）相比活性略有下降，但是其選擇性則是高達38倍之多。

圖1. AF9/ENL YEATS結構域結構對比、環肽抑制劑設計策略和相應結構

為了進一步闡述環肽抑制劑高選擇性的分子機理，作者解析了AF9 YEATS結構域與JYX-3的三維晶體結構。結構顯示如預期一樣，JYX-3與AF9 YEATS之間保持了關鍵的互作對，包括核心結合口袋關鍵胺基酸F59、Y78與K-oxa之間的π堆積結構，S58、W32與K-oxa之間的拉力氫鍵，Cbz基團與H107及H111之間的π堆積結構，以及成環部分與D103之間的氫鍵相互作用。成環之後的抑制劑剛性增加，遇到比較剛性的ENL Loop8時，將產生較大的空間位阻使得二者無法有效結合。作者對AF9和ENL YEATS結構域Loop 8處第107位及第111位這兩個關鍵胺基酸進行了swap突變，獲得了相對應的雙突變體AF9NN和ENLHH。活性結果表明，其選擇性竟然相應地實現了反轉，由原先的38倍選擇性變成了0.25倍。為了進一步闡釋Cbz基團對於高選擇性的貢獻，作者接著做了相應的構效分析研究，通過採用不同的基團取代原有Cbz基團，設計合成出了一系列環肽抑制劑類似物，最終發現Cbz基團仍然是最佳結構。無論是構效分析研究還是蛋白突變體的研究都進一步闡述了Cbz基團與組氨酸形成的π堆積結構對環肽抑制劑選擇性的決定作用。

 

圖2. AF9 YEATS結構域與JYX-3的複合物晶體結構及Cbz對高特異性的貢獻

接下來作者對JYX-3開展了細胞層面的活性研究。首先作者利用IAM和PAMPA技術表徵了JYX-3的細胞通透性，同時開展相關的穩定性探究，結果表明通過環化之後，與線狀抑制劑相比環肽抑制劑確實可以提高相應的細胞通透性以及穩定性。作者又相繼進行了在細胞核提取物中的下拉實驗，研究表明JYX-3在內源性蛋白水平層面上具備有良好的活性以及選擇性。而隨後的在活細胞內熱穩定性遷移實驗（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）中，進一步揭示了JYX-3可以透過細胞膜，並特異性地靶向細胞內源的AF9而不會作用於內源的ENL蛋白。此外，作者又利用螢光漂白恢復技術（Fluorescence Recovery after Photobleaching，FRAP）證明了JYX-3能有有效阻止AF9與染色質的結合，而相應地對ENL卻沒有明顯作用，進一步驗證了其在細胞層面上的選擇性。更重要的是，ChIP-qPCR和RT-PCR實驗表明在HeLa細胞系中，JYX-3處理會阻礙AF9和其靶基因（MYC和PABPC1）的結合併顯著性降低這些致癌基因的表達。

圖3. JYX-3對AF9的高選擇性以及細胞層面的作用

綜上，該論文是首個針對AF9 YEATS結構域高選擇性環肽抑制劑的報導，同時進一步闡述了環肽抑制劑高選擇性的分子機理，所發現的Cbz-組氨酸形成的π堆積結構為今後YEATS結構域或其他保守結構域的高選擇性抑制劑的開發提供了新的思路。

李祥組博士研究生薑益翔，李海濤組研究助理陳國超以及李祥組李曉萌博士為共同第一作者，李祥教授、李海濤教授，以及李祥組李歆博士和李海濤組副研究員李元元博士為共同通訊作者。

1. Li, Y. et al. AF9 YEATS domain links histone acetylation to DOT1L-mediated H3K79 methylation. Cell 159, 558–571 (2014).

2. Li, Y. et al. Molecular coupling of histone crotonylation and active transcription by AF9 YEATS domain. Mol. Cell 62, 181–193 (2016).

3. Andrews, F. H. et al. The Taf14 YEATS domain is a reader of histone crotonylation. Nat. Chem. Biol. 12, 396–398 (2016).

4. Zhao, D. et al. YEATS2 is a selective histone crotonylation reader. Cell Res. 26, 629–632 (2016).

5. Zhang, Q. et al. Structural insights into histone crotonyl-lysine recognition by the AF9 YEATS domain. Structure 24, 1606–1612 (2016).

6. Ren, X. et al. Histone benzoylation serves as an epigenetic mark for DPF and YEATS family proteins. Nucleic Acids Res. Doi:10.1093/nar/gkaa1130 (2020).

7. Wan, L. et al. ENL links histone acetylation to oncogenic gene expression in acute myeloid leukemia. Nature 543, 265-269 (2017).

8. Wan, L. et al. Impaired cell fate through gain-of-function mutations in a chromatin reader. Nature 577, 121-126 (2020).

9. Schulze, J. M., Wang, A. Y. & Kobor, M. S. YEATS domain proteins: a diverse family with many links to chromatin modification and transcription. Biochem. Cell. Biol. 87, 65–75 (2009).

10. Li, X. et al. Structure-guided development of YEATS domain inhibitors by targeting π-π-π stacking. Nat. Chem. Biol. 14, 1140–1149 (2018).

11. He, N. H. et al. Human Polymerase-Associated Factor com-plex (PAFc) connects the Super Elongation Complex (SEC) to RNA polymerase II on chromatin. Proc Natl Acad Sci 108, E636–E645 (2011).