U-2共建造86架左右，初期折損率非常高，自1957年美國空軍開始使用U-2後1年半內就損失了9架，截至2001年有40架嚴重損壞或全毀，曾多次於蘇聯(1次)、古巴(1次)及中國大陸(5次)上空被擊落。其中一些U-2更是自損毀的飛機中取得零件建造。
從1956年到1960年對蘇聯領空實施了50次偵察，曾先後出現在基輔、莫斯科、明斯克、克裡米亞、遠東和中亞等地上空。蘇聯於1956年首次出動米格－17戰機無功而返後，蘇聯領導人還不相信這一事實，並召集航空專家詢問。專家回答稱，世界上還沒有能夠飛到兩萬米以上高空的飛機，因此指責飛行員謊報軍情。此笑話前提是飛行員在廣闊的蘇聯領空中正巧飛到U2下方，飛行員正巧抬頭仰望發現了上方空域一萬米的U2，事實上56年各國機載雷達尚十分原始，米格17也僅有少量配備了雷達，蘇聯飛機對U2的攔截全部是地面遠程雷達發現U2定位測高后，指引附近的飛機前往攔截。直到1959年底，蘇聯防空軍才裝備S－75新型防空飛彈，之後又裝備了飛行高度可達兩萬米的SU-9飛機，從而結束了西方高空偵察機在蘇聯領空暢行無阻的歷史。
1960年U-2擊墜事件
1960年5月1日，一架U-2於葉卡捷琳堡附近被SA-2防空飛彈擊落，飛行員加裡·鮑爾斯成功彈射逃生後被俘，1962年2月10日獲釋。
鮑爾斯座機於20000米的高度上被SA2近爆擊傷，按規定程序因該關閉引擎，打開延時自爆開關，然後彈射逃生，並配有一枚藏有毒針的特製1美元硬幣，以備在無法逃脫時自殺，避免被俘。但鮑爾斯並未打開自毀裝置，也未彈射，而是等飛機降至約10000米後自己爬出座艙跳傘。因U2深入蘇聯領空的偵查任務必須由總統批准，時任美國總統德懷特·大衛·艾森豪得知U2被擊落後大為震怒，說「他們跟我說這是架俄國人的雷達探測不到的飛機」，隨後在認為偵查設備已自毀鮑爾斯已身亡的情況下釋放假信息，聲明這是NASA的一架氣象機，並拉NASA出來作證。1960年5月7日，時任蘇聯主席尼基塔·謝爾蓋耶維奇·赫魯雪夫發表了一個驚人言論：「 我一定要告訴你們一個秘密。我在第一次報告時刻意沒有說那駕駛員仍然生還，嗯……現在看看美國人說了多少的蠢話。」 —尼基塔·赫魯雪夫。不單只是鮑爾斯生還，飛機殘骸也基本上十分完好。蘇聯軍方更成功尋回偵照的照相機，並將加利·鮑爾斯所攝的底片衝洗出來。隨著這些東西能證明該架飛機的確為偵察機的事證曝光，導致以德懷特·艾森豪為首的美國政府蒙受屈辱，而也使協助「隱瞞」的太空總署的官員尷尬。而鮑爾斯的求生包也被尋回，其中包括一些女性首飾和價值7,500盧布的各國貨幣甚至有10枚拿破崙金幣。鮑爾斯攜帶的藏有毒針的硬幣也被識破。
1962年2月10日，鮑爾斯與克格勃上校維利亞姆·費舍爾（又名魯道夫·阿貝爾）交換後返美。
於中國大陸上空被擊落的U-2
所有於中華人民共和國被擊落的U-2都隸屬黑貓中隊。
1962年9月9日，於江西南昌上空被擊落，飛行員陳懷生被俘，送院後不治。
1963年11月1日，於江西上饒上空被擊落，飛行員葉常棣被俘，於1982年11月10日獲釋。
1964年7月7日，於福建漳州上空被擊落，飛行員李南屏殉職。
1965年1月10日，於內蒙古包頭上空被擊落，飛行員張立義被俘，於1982年11月10日獲釋。
1967年9月9日，於浙江嘉興上空被擊落，飛行員黃榮北殉職。
於古巴上空被擊落的U-2
1962年10月27日，一架隸屬第4080戰略偵察聯隊的U-2於古巴上空被SA-2防空飛彈擊落，飛行員魯道夫·安德遜少校身亡。
其他意外
2003年1月26日，一架U-2於韓國烏山空軍基地附近墜毀，傷及地面3名韓國民眾，該機全毀並對周圍造成嚴重破壞。飛行員彈射逃生受輕傷。事件調查報告指發動機出現問題及天氣惡劣導致意外。
2005年6月21日22時30分（UT）一架U-2自阿富汗執行任務後於回航途中墜毀。於事故中殉職的飛行員隸屬基地位於阿布達比宰夫拉空軍基地的第380空中遠徵聯隊。空軍調查認為飛機於夜間接近基地預備著陸時墜毀，當時飛機出現機械故障導致液壓、主儀表顯示器和內部照明失靈。令飛行員誤認為發動機失效，飛機一直下降直至墜毀。