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我怎麼也沒想到，古老的砒霜會在21世紀與最強抑癌蛋白p53相遇，而且還成為恢復突變p53抑癌能力的最強「潛力股」。
近日，由上海交通大學瑞金醫院盧敏和牛津大學Xin Lu領銜的研究團隊發現，砒霜（三氧化二砷，ATO）中的砷原子竟然能插入發生結構性突變、不能正常摺疊的p53蛋白的DNA結合域，幫助突變p53蛋白摺疊出有抑癌功能的三級結構[1]。
更重要的是，這項研究成果一舉解決了困擾p53靶向藥物開發的兩大科學難題：無邏輯、無口袋。
換句話說，盧敏等的研究成果證實：一直被認為缺乏邏輯支撐的「通過靶向藥物恢復突變蛋白活性」的思路，在p53蛋白上是可行的；一向被認為缺乏靶向藥物結合口袋的p53蛋白，確實隱藏著一個不為人知的砷原子結合口袋。
總的來說，這是抑癌蛋白p53靶向治療近40年來取得的重大突破，靶向治療或由此迎來新一輪爆發。基於本研究成果的相關臨床研究（PANDA-T0；NCT03855371），也在瑞金醫院的主持下開展[2]。
相關研究成果發表在著名期刊Cancer Cell上，盧敏和Xin Lu是共同通訊作者，陳碩、Wu JiaLe、Liang Ying、Tang YiGang為共同第一作者。
▲ 本研究論文截圖
小分子靶向治療藥物的誕生，改寫了很多癌症的治療範式。
然而，目前已經獲批用於臨床治療的靶向藥物覆蓋的患者並不多。這在一定程度上是受靶向藥物開發策略的影響。
我們都知道，在人體內有原癌基因和抑癌基因。原癌基因突變後，就會編碼癌蛋白，誘發癌症；而抑癌基因突變，會導致抑癌蛋白失去抑制癌症形成和發展的能力。因此，從理論上講，消除癌蛋白和恢復抑癌蛋白活性，都能用於癌症的治療。
不過，事情並沒有那麼簡單。
以各種各樣激酶為代表的癌蛋白存在一個與ATP結合的口袋，只要開發相關藥物，能佔據或阻止ATP的進入，即可抑制癌蛋白的促癌活性。
而因突變失活的抑癌蛋白，開發藥物的思路則完全是要反其道而行之：恢復抑癌蛋白的活性。這項拯救工作的難度有多大，從臨床獲批的藥物就能看出來。投入臨床使用的癌蛋白靶向藥物已經有100多個了，而抑癌蛋白的靶向藥物這一數據是0。
這背後的主要原因是：第一，恢復蛋白功能從邏輯上講是極難實現的；第二，抑癌蛋白缺少讓小分子藥物結合的口袋。
儘管開發抑癌蛋白靶向藥物難度極大，但還是阻擋不住科學家的熱情。就拿p53這個抑癌蛋白來說，全球約50%的癌症患者發生突變。這也就意味著，從理論上講，僅p53靶向藥物就可用於治療全球約50%的癌症患者，而目前已經獲批用於臨床治療的100多個靶向抗癌藥加在一起，也僅能用於2-13%癌症患者的治療[3，4]。
▲ p53突變所佔比例
也正是因為這個原因，p53成為迄今為止被研究的最多的蛋白[5]。
科學家們的努力也沒有白費。
現在我們已經知道，由393個胺基酸組成抑癌蛋白p53包括3個功能域：發揮轉錄激活作用的N端功能域；幫助p53定位的C端功能域；以及位於中間的DNA結合域（DBD）[6]。
p53的突變類型多樣，有基因片段缺失、插入，點突變引起的錯義突變等。不過，在所有突變類型中，佔主導地位的還是點突變引起的錯義突變，佔比高達80%[6]。更重要的是，97%的點突變發生在DNA結合域[6]。
從結構上看，上述點突變對p53 和DNA相互作用影響的機制可以分成兩類[7，8]：其中一些p53突變（如突變熱點Arg248和Arg273處的突變）導致p53不能與DNA接觸；而其餘的許多突變則被稱為結構性突變（如熱點Arg175、Gly245、Arg249和Arg282處的突變），這些突變損害了p53的DNA結合域（DBD）結構，導致p53無法正常摺疊，不能與DNA緊密結合，因此喪失了抑癌能力。
▲ 不難看出，p53突變不僅主要分布在DBD區域，而且異質性非常高
實際上，在過去的幾十年裡，科學家已經發現了很多有拯救p53突變潛力的先導化合物[9，10]，只不過這些化合物恢復p53功能的效率比較低。
儘管如此，盧敏和他的同事還是認真研究了這些化合物的特點。他們注意到這些化合物都有一個有趣的特點，即能夠結合半胱氨酸的硫醇基團[9，11]。
基於此，他們進一步假設，當p53的DNA結合域被結構性突變損害時，那些能夠結合多個半胱氨酸的化合物或許可以穩定p53，恢復p53的抑癌活性。他們還推測，通過這種方法，或許能找到拯救p53結構性突變的通用化合物，而這些突變合計佔所有p53突變的一半以上。
▲ 假想的候選化合物可能的結合位點
有了上述假設之後，盧敏團隊就開始著手篩選能與2個及以上半胱氨酸結合的小分子。最後通過5個具有p53結構性熱點突變的細胞系（R175H等）實驗，從DTP資料庫的20861個小分子[12]中篩選到4個化合物。
▲ 篩選到的4個化合物結構
通過優先識別摺疊p53蛋白的抗體PAb1620檢測，研究人員發現，砒霜和KAsO2對有R175H結構性突變p53蛋白的摺疊存在驚人促進作用。簡單地說，就是砒霜能恢復有R175H結構性突變p53蛋白的抑癌活性。而另外兩種化合物的這種活性則要弱的多。
隨後研究人員用另外4個不同的p53結構性突變細胞系檢驗了砒霜的效果，用PAb1620抗體檢測發現，竟達到了野生p53蛋白的水準。
劑量研究表明，僅需低至0.1μg/mL的砒霜，就足以促進結構性突變p53蛋白在給藥的15分鐘之後正確摺疊。
總的來說，研究人員通過多級篩選研究，確定了含砷化合物能有效地重新激活最常見的p53結構性突變體。
隨後的研究發現，砒霜是通過共價結合穩定結構性突變的p53摺疊。而且與之前發現的化合物，以及本研究中發現的其他化合物相比，砒霜的穩定作用遠超其他化合物。
▲ 砒霜與其他化合物的共價結合比較
為了弄清楚砒霜恢復結構性突變p53的機制，盧敏團隊10餘位成員又花費近6年時間完成了p53-砷共結晶結構的解析，明確了p53功能復活的機制[13]。總的來看，p53-砷複合物與已公布的p53 DBD結構重疊性良好。
具體來看，砷與DNA結合域的Cys124、Cys135和Cys141相互作用，與此同時，Met133的側鏈朝向砷，並與砷原子之間存在範德華相互作用。正是DNA結合域中的這4個胺基酸殘基，搭建了一個可以與砷原子結合的口袋。
▲ 砷原子結合口袋全貌
由於p53本質上是一個轉錄因子，因此檢驗結構性突變p53功能恢復的辦法之一是檢測轉錄的激活狀況。研究結果顯示，砒霜能介導所有攜帶結構性突變p53的測試細胞系轉錄重新激活，而對於影響p53與DNA接觸的突變類型，砒霜則沒有激活的作用。
既然如此，砒霜的抗癌效果究竟如何呢？
盧敏團隊隨後在CDX和PDX小鼠模型上探索了砒霜的抗癌效果。砒霜的使用劑量是5mg/kg，這個劑量在小鼠中產生0.05-0.2μg/mL 砷血漿濃度，在砒霜治療的急性早幼粒細胞白血病（APL）患者中可以達到，而且不會產生嚴重的毒性[14，15]。
血液腫瘤的研究顯示，砒霜顯著延長了小鼠的中位生存時間，而實體瘤研究也顯示，小鼠的腫瘤體積僅為對照組的10%左右。
以上的研究表明，砒霜確實有強烈的抑癌作用。
▲ 血癌（上）和實體瘤（下）的研究結果
而且與一線化療藥物順鉑的比較顯示，砒霜對非小細胞肺癌的抑制作用與順鉑相似。
分析背後的作用機制發現，在砒霜處理的PDX腫瘤中檢測到p21的上調，而在順鉑處理的PDX腫瘤中沒有檢測到。
相比之下，與對照組相比，順鉑處理的腫瘤中DNA損傷標誌物表達的增強更為強烈，而砒霜處理的腫瘤中沒有。
這也意味著順鉑和砒霜的抗癌機制並不相同，而且砒霜抗癌的原因至少有部分是因為重新激活了結構性突變的p53蛋白。
▲ 順鉑（CIS）和砒霜（ATO）的比較
在研究的最後，盧敏團隊成員探討了另一個重要的問題：砒霜的適用範圍究竟有多大。
於是他們挑選了25個最常見的p53突變，它們都位於DNA結合域，且佔到了癌症中p53錯義突變的40.87%。其中18個是結構性突變，另外7個是DNA接觸性突變。
▲ 25個突變的分布
總的來看，大部分結構性突變的p53被砒霜拯救，只是程度不盡相同。而DNA接觸性突變p53，則沒有被砒霜拯救。
隨後的細胞系研究也證實，砒霜對具有結構性突變p53的癌細胞系顯示出明顯更強的殺傷力。
▲ 砒霜的不同類型突變細胞系研究
總的來說，盧敏團隊的研究非常有系統性，確定了砒霜恢復結構性突變p53抑癌功能的潛力。這個研究還一舉解決了困擾p53靶向藥物研發的兩大科學難題，證明了靶向抑癌蛋白確有其邏輯，而且也存在小分子化合物結合的口袋。
▲ 本研究主要內容總結
由於砒霜已被我國科學家開發成為治療APL的藥物，因此將其開發成p53突變癌症的治療藥物有大量的臨床經驗可以借鑑，這無疑會加快其臨床開發速度。好消息是相關的臨床研究已經開展。
更重要的是，這個研究提出了抑癌蛋白靶向治療的思路，或將開啟靶向治療新時代。
參考文獻：
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本文作者 | BioTalker
汝之砒霜，彼之蜜糖
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