...團隊合作揭示單羧酸轉運蛋白的質子偶聯轉運機制和候選抗癌藥物...

以乳酸、丙酮酸和酮體為代表的單羧酸是大多數哺乳動物細胞中必需的代謝產物。這些單羧酸代謝物的動態吸收和再分配是由單羧酸轉運蛋白（monocarboxylate transporter， MCT）完成的。人體內的單羧酸轉運蛋白有兩種類型：質子偶聯的單羧酸轉運蛋白（MCTs）和鈉離子偶聯的單羧酸轉運蛋白（SMCTs）。

 

MCTs屬於溶質轉運蛋白家族16（SLC16）或MFS超家族。在14種已鑑定的MCT中，MCT1-MCT4在多種組織中表達，催化一元羧酸的質子偶聯雙向轉運。而MCT1是最早被發現且廣泛分布在各組織細胞中、維持細胞基本穩態的重要亞型。MCT1-4的膜定位需要糖基化分子伴侶蛋白，如協助MCT1、3和4定位的分子伴侶Basigin（也稱為CD147或EMMPRIN）和協助MCT2定位的分子伴侶Embigin（或gp-70）。

 

在生理條件下，MCT1-4協同糖酵解型細胞和氧化型細胞之間的乳酸穿梭，這是不同組織中乳酸穩態的關鍵過程。該過程對於肌細胞和神經細胞的能量代謝具有重要作用，如運動過程中白肌細胞產生的乳酸會被氧化型的紅肌細胞吸收，以糖酵解為主的神經膠質細胞產生的乳酸會被氧化型為主的神經元吸收。因此MCT1的異常表達或者功能失活會導致多種人類疾病，包括乳酸轉運缺陷症（SDLT）、家族性高胰島素性低血糖（HHF7）和單羧酸轉運蛋白1缺乏症（MCT1D）。同時MCTs的表達改變也與神經退行性疾病、癲癇、腦缺血等多種腦疾病密切相關。更重要的是，MCT1、2和4在多種癌症中的高表達與癌症的發展有密切關係。由MCT1和其他亞型共同介導的乳酸穿梭能夠連接以糖酵解為主要產能方式（Glycolytic tumor cell）和以線粒體氧化為主要產能方式（Oxidative tumor cell）的癌細胞使其形成協同代謝，從而促進腫瘤的發生與發展（圖1）。

 

圖1 MCT1-4介導的糖酵解型和氧化型腫瘤細胞之間的乳酸穿梭

 

由於其在癌症發生中的重要作用，MCT1被認為是重要的癌症治療靶點。多個早期研究已指出抑制MCT1活性能夠有效減緩癌細胞的生長和增殖。同時多個以MCT1為靶點的小分子抑制劑也被報導。其中，以正在進行針對癌症一期臨床實驗的AZD3965分子最為引人注目。然而，由於缺乏結構信息，MCT1的轉運機理和小分子抑制劑的抑制機制一直未被闡明。

 

2020年12月16日，清華大學研究員閆創業課題組和澳大利亞新南威爾斯大學研究員蔣鑫課題組合作在Cell上發表了文章Structural basis of human monocarboxylate transporter 1 inhibition by anti-cancer drug candidates，揭示了候選抗癌藥物對人源單羧酸轉運蛋白抑制機理（圖2）。

圖2 MCT1/Basigin-2複合物與天然底物及三種經典小分子抑制劑在不同構象下的結構

該論文報導了MCT1和其伴侶蛋白Basigin-2在結合天然底物乳酸和不同小分子底物抑制劑的單顆粒冷凍電鏡結構。通過對比外向開口構象（Outward-facing conformation）的野生型MCT1結構和模擬持續質子化的D309N突變體的內向開口構象（Inward-facing conformation）結構，研究人員闡明了MCT1的底物識別、質子偶聯轉運和交替開放的機理（圖3A）。更進一步，文章通過解析MCT1/Basigin-2蛋白複合體與三個代表性小分子抑制劑AZD3965、BAY-8002和7ACC2的結構在近原子水平上闡明了不同構象下小分子抑制劑與MCT1蛋白的結合模式。（圖3B）。

圖3 單羧酸轉運蛋白MCT1的轉運機制和小分子抑制劑的抑制機理

 

作為一期臨床實驗中的先導化合物，AZD3965代表了最有希望成為抗癌藥物的MCT1抑制劑。然而，由於AZD3965對於MCT1的選擇性抑制，其對於MCT1和MCT4高表達的癌細胞殺傷效果欠佳。為了給進一步藥物優化提供信息，研究人員根據MCT1/Basigin-2與AZD3965結合的複合物結構信息設計了一系列的突變體，通過生化功能實驗闡明了AZD3965對MCT亞型的選擇性機理。由此，該工作通過結構生物學和生物化學相結合的手段闡明MCT1的轉運機理和小分子抗癌候選藥物的抑制機制，為進一步靶向MCTs的藥物發現奠定了基礎。

 

值得一提的是，MCT1/Basigin-2複合物沒有對稱性且分子量只有大約80kDa，並且胞外區域比較柔性，只有50kDa的穿膜區比較穩定，這對冷凍電鏡的結構解析形成了巨大挑戰。為了解決這些技術難題，研究人員設計了一種「降噪-再加權」(Noise reduction and re-weighting methods)的新型數據處理方法，結合之前開發的「引導性多參照三維分類」(Guided multi-reference 3D classification)方法，以及新的優選顆粒輔助三維分類方法（Seed-facilitated 3D classification）有效地消除了蛋白外的噪音信號，進一步突破了冷凍電鏡解析非對稱性膜蛋白樣品的分子量下限，解析度達到3 Å（圖2C、D）。這一方法將為進一步研究低分子量、非對稱性膜蛋白提供新的思路。 

文章的共同通訊作者為清華大學生命科學學院研究員閆創業和澳大利亞新南威爾斯大學研究員蔣鑫；清華大學生命科學學院2016級博士生王楠和新南威爾斯大學研究員蔣鑫為本文的共同第一作者；清華大學生命學院2017級博士生張碩和2019級博士生朱盎岐參與了數據收集和生化實驗；清華大學生命學院博士後袁亞飛、技術員徐翰文對本研究提供了幫助；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數據收集提供了幫助。實驗的電鏡數據採集受到清華大學冷凍電鏡平臺和西湖大學冷凍電鏡平臺的支持，實驗的計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。

論文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.043