爬行動物發育的許多特徵都受到溫度的影響，但關於孵化溫度如何影響基因表達卻知之甚少。本文研究了巖蜥胚胎發生早期的一個精確的發育階段，在低溫15℃和適宜的24℃溫度下發育的基因表達譜，使用窩間分離設計和四個不同種群的蜥蜴評估溫度對基因表達譜影響的穩健性。低溫孵化的胚胎比在適宜溫度下孵化的胚胎平均表達的總RNA少20%，這可能反映了低溫下轉錄速率較低；約50%的轉錄產物在兩個孵育溫度之間顯示出顯著的差異；表達譜變化最大的轉錄本與轉錄和翻譯調節以及染色質重塑有關，表明早期胚胎可能有適應低溫的表觀遺傳機制。同時分析了轉錄組數據來研究個體及群體如何適應熱壓力。
溫度深刻地影響幾乎所有的發育過程和生物功能。低溫降低了生化反應的速度，從而減緩了生長和分化。溫度脅迫會損害外溫動物的發育，目前缺乏對更長時間暴露在亞臨界溫度下影響的研究，假設這種溫度也可能引發適應性塑性反應，確保發育能夠持續。本研究通過RNA測序表徵暴露於持續低溫下巖蜥胚胎的轉錄組，使用了四個巖蜥種群（兩個來自法國，兩個來自義大利中部）來評估低溫孵育對早期胚胎基因表達的影響，並測試不同種群之間溫度特異性基因表達的保守性。研究發現大部分轉錄組在15℃和24℃有差異，體現在基因表達調控、蛋白質摺疊、表觀遺傳修飾和細胞周期調控四個方面。
對基因表達的總體水平的評估表明，適宜溫度孵化下胚胎的總RNA含量明顯高於低溫孵化的胚胎（每個胚胎的平均總RNA：適宜溫度為8.97μg，低孵化溫度為7.11 μg；p值< 0.01，配對t檢驗）。
結果顯示最大比例的變異主要是由於群體間的差異導致的（圖1B），表達水平差異的第一組分能區分兩個地理種群（義大利和法國）群體的差異。第二組分能區分孵化溫度引起的差異。這兩個組分共解釋了48%的變異，第三和第四組分共解釋了16%的差異。另外，兩個法國群體之間的基因表達差異映射到區分義大利和法國群體的相同基因，而不是參與溫度反應的基因。tSNE投影強調了基因表達在四個主要樣本組之間明顯分離，分別對應於法國和義大利群體以及冷溫孵育溫度（圖1C和D）。
為了確認不同群體對冷孵育處理是否有不同反應，使用sleuth將一個具有「溫度」和「群體」及其交互項的完整模型與一個缺乏交互項的簡化模型進行比較。兩個模型之間的似然比檢驗（LRT）顯示，只有三個轉錄本具有顯著的交互項（表S1），因此在所有群體中對不同孵育溫度的轉錄反應是保守的。接下來比較了簡化模型（溫度和種群都是主要影響，但沒有交互項）和只包含兩項中一項的模型。在校正FDR後，LRT表明11797個轉錄本（轉錄組的53%）在兩個溫度之間有差異表達，4632個轉錄本（轉錄組的21%）在四個群體中的至少兩個群體之間有差異表達。這些轉錄本的特性表明，它們可能參與轉錄或翻譯調節（TATA盒結合蛋白相關因子、轉錄因子、eIF3J）、入核（核轉運蛋白5）或染色質重塑（CBX蛋 白）。（表1）
使用DESeq2軟體進行相應的交互驗證，用如上所述的完整模型，發現了七個轉錄本具有顯著的交互項（包括由sleuth確定的三個轉錄本，表S1）；當用沒有交互項的簡化模型時，在校正FDR後，8941個轉錄本（41%）在不同孵育溫度下差異表達，3682個轉錄本（17%）在群體間差異表達。絕大多數差異表達的轉錄物通過sleuth和DESeq2兩種分析得到一致鑑定 （圖2a）。
WGCNA聚類總共生成了30個模塊，加上一個包含2570個轉錄本的與任何模塊的表達譜都不匹配的「灰色」模塊。通過每個模塊的第一主成分或特徵基因（圖S1）來總結每個模塊的表達譜。在22個模塊中發現了對溫度的顯著反應，包括16503個轉錄本（佔轉錄本的75%）；在13個模塊中發現了群體間的顯著差異，包括7198個轉錄本（佔轉錄本的33%）；9個模塊（4825個轉錄本）顯示孵育溫度和群體之間的顯著表達差異。儘管模塊之間存在差異，但窩解釋的差異在溫度敏感、群體特異性和 非差異表達的模塊之間是相似的。
GO分析顯示，最能區分溫度狀態的轉錄本超過了74個GO terms。其中，51個GO term屬於「生物過程」範疇，10個屬於「分子功能」，13個屬於「細胞成分」。「生物過程」主要屬於六個不同的領域（圖2b）:分子伴侶介導的蛋白質摺疊、細胞周期調控、組蛋白修飾、染色質組、轉錄調節和翻譯延伸；「分子功能」（圖2c）包括熱休克蛋白、組蛋白乙醯化、轉錄和翻譯調節以及解旋酶，解旋酶可能參與轉錄或有絲分裂相關過程中雙鏈DNA的解鏈；「細胞成分」（圖2d）表明組蛋白乙醯化複合物、細胞分裂所需的動粒和紡錘體極以及翻譯所需的前核糖體相關的轉錄物過多。
本研究首次描述了不同的孵化溫度如何影響爬行動物胚胎的轉錄，並發現在持續暴露於亞最佳低溫培養溫度後，大約一半的轉錄本在巖蜥胚胎的咽期差異表達。溫度反應在很大程度上獨立於群體間基因表達的地理（和遺傳）差異。不同群體之間的轉錄本參與溫度反應的頻率低於預期，表明隨著溫度的升高或降低而表達上調的基因在群體之間不太可能發生差異。此外，主成分分析和差異表達結果表明，群體差異主要是由少量基因表現較大的表達差異引起的，而溫度反應涉及更多的轉錄本的較小的表達變化。富集分析還揭示了在溫度響應基因中與有絲分裂細胞周期調控相關基因的過度表達。推測較低的溫度可能會破壞細胞周期調節，導致維持細胞分裂的調節因子表達增加；或者有絲分裂速度的增加可以部分抵消由較低溫度引起的發育速度的減慢，幫助胚胎完成發育。
這些結果有許多重要的生物學意義。首先，孵育溫度對生理過程有很大影響，冷孵育胚胎中總RNA的水平降低（與良性溫度相比降低了約20%）；在分子水平上，發現暴露於低溫的胚胎中富集與核糖體產生和功能相關的轉錄本，表明翻譯成蛋白質的速率可能受溫度影響。其次，差異表達轉錄物的推定功能也表明溫度對轉錄有很大影響。例如，一致認為轉錄調節因子和延伸因子是溫度狀態的判別因子。溫度脅迫還引發了染色質重塑（核小體和組蛋白修飾）相關基因表達的變化，推測差異表達的染色質修飾因子調節基因表達，使胚胎適應變化的孵育溫度。
（補充圖表：https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1002%2Fjez.2175&file=jez2175-sup-0003-SuppMat3.pdf）
長按識別二維碼
關注漫畫生態學
ID：eEcology
校對：屈彥福 計翔
南京師範大學