楊正紅:氮吸附儀表徵藥物超低比表面積的技術突破

藥物粉體是大部分藥物製劑的主體，其療效不僅取決於藥物的種類，而且很大程度上還取決於組成藥劑的粉體性能，包括粒度、形狀、表面特性等各類參數。藥物粉體的比表面積和孔徑關係到粉末顆粒的粒徑、吸溼性、溶解度、溶出度和壓實度等性能，而且最終影響到藥物的生物利用度。國家藥典委員會已頒布了最新的2020年版中國藥典，增加了0991比表面積測定法，並將於2020年12月30日起正式實施。

用氣體吸附法進行比表面和孔徑分布測定，對於大多數製藥行業的用戶還比較陌生。作為畢業於藥學院並從事氣體吸附比表面和孔徑分析20餘年的科學工作者，有責任與大家分享一下我對0991的見解及氣體吸附法測定比表面的最新技術發展。 

一、中國藥典2020版要求在相對壓力P/P₀為0.05-0.3範圍內至少進行3個壓力點的測試，且BET方程相關係數需大於0.9975

1、有關BET比表面積的測量和計算：

首先需要明確的是，BET比表面積是通過多層吸附理論（BET方程）計算出來的，而不是測出來的。我們需要測定的是液氮溫度下的樣品對氮氣吸附的等溫線，而發生多層吸附的區域多數是在P/P₀0.05-0.3的範圍內，吸附曲線在這裡進入平臺區（圖1）。BET理論恰恰需要這個階段的吸附數據來計算比表面積。完整的BET報告必須包括比表面值、回歸曲線、相關係數和C常數（C值，圖2）。

2、有關BET計算的P/P₀取點：

眾所周知，藥典是製藥行業的憲法，是基本法，也就是最低標準。0991的相關數據應該引自美國藥典USP846，適用於介孔材料。但是，隨著近些年納米科技的發展和新型藥品和藥用材料的研發成功，已經開始應用多微孔的納米載體材料控制藥物緩釋速度，而這些材料的多層吸附區域會前移，也就是可能到P/P₀為0.01~0.15的範圍，這樣藥典中的取點範圍就顯得不合時宜了。因此，判斷BET計算結果可靠性的標準應該是C值大於0和回歸係數大於0.9999。

（延伸閱讀：楊正紅：《物理吸附100問》化工出版社，2016年）

3、有關BET方程相關係數：

回歸曲線的相關係數R=0.9975是對吸附等溫線測定質量的過於粗放的低端要求，來源於20年前的技術水平。由於比表面測定過程中有許多不可控因素，所以很難獲得穩定重複的結果。因此，業內有「BET差5%不算差」的說法，由此，按允許偏差±5計算：

R = （1+0.0500）x （1-0.0500）= 0.997500

由於BET的計算是取自多層吸附已經完成，孔中的毛細管凝聚尚未發生的平緩線性階段數據，這顯然是一個到達極限的最低標準。以這麼低的標準去進行比表面測定的質量控制，實際上等於沒有控制。目前所有的全自動物理吸附分析儀都標榜重複性偏差不超過±2，這意味著：

R = （1+0.0200）x （1-0.0200）= 0.999600

也就是說，R值不應該低於0.9996。

如果按常規質檢要求，重複性允許偏差±1計算，則對R值的最低要求為：

R = （1+0.0100）x （1-0.0100）= 0.999900

即回歸曲線的相關係數不小於四個9（R > 0.9999）。

 

二、表徵超低比表面積的技術突破

由於真空體積法氣體吸附分析儀等溫線測定依據的是理想氣體方程，影響結果的主要因素不外乎溫度、壓力和體積。當樣品的吸附量遠大於這些因素引起的誤差時，溫度、壓力和體積的波動或精度誤差（儀器的本底噪音）可以被忽略不計，但是當藥品這樣的小表面材料所能吸附樣品總量不足以克服本底噪音時，就帶來了測試結果的不穩定性，甚至測不出來。

為了解決超低比表面材料的質量控制的痛點問題，我們專門開發設計了iPore 400，該儀器從影響比表面測定的因素入手，嚴格控制由溫度、體積和壓力測量帶來的誤差，採用了一系列新技術，配合全自動智能脫氣站，建立了新一代物理吸附儀的技術標準（圖3）。它包括：

（1） 全域自動恆溫系統：擁有雙路進氣預熱管路及包括12個靜音風扇組成的高精度恆溫系統（圖4），可根據需要在35-50℃之間設定恆定溫度。系統實時顯示全區域氣路和歧管的溫度，避免環境因素帶來的誤差。

a) 內部整體恆溫，可在35-50℃之間設置：真空體積法是通過壓力傳感器讀取壓力的變化而計算吸附量的，其準確性和有效精度對溫度變化極其敏感，尤其在微孔和超低比表面分析中。

b) 0.02℃溫控精度：三個溫度傳感器，實時顯示各區域溫度。高精度和高穩定的全恆溫控制，可將壓力變化控制在0.05%以內，遠小於傳感器本身的不確定度（0.1%），可徹底避免因環境溫度變化造成的分析誤差。可根據地區需要和數據對比需要調節恆定溫度。

c) 進氣預熱恆溫： 由於涉及安全管理問題，大多數實驗室氣瓶置於室外，造成吸附氣進氣溫度與室溫或儀器內溫差距巨大，定量注氣失準。該系統消滅了地區差別和早晚溫差對鋼瓶氣造成的誤差，尤其為鋰電材料，藥物材料，膜材料的等小比表面質量控制帶來福音。

d) 新型電磁閥：常規電磁閥的發熱問題由來已久，嚴重影響氣體定量和壓力讀數的準確性，該問題在超低比表面和微孔分析時尤為突出。為解決這一問題所開發的帶有自鎖功能的電磁閥，無需持續供電便可保持開啟或關閉狀態，發熱量等效為零，消除了電磁閥工作中發熱引起的測量誤差，極大地提升了分析性能。

（2） 壓敏死體積恆定技術：通過壓力傳感器和伺服反饋電梯精確控制液氮液位，保持過程中死體積恆定。

【專利號：ZL 2019  885784.5】

真空體積法物理吸附是在一個密閉空間進行的。自由空間是系統中吸附質分子傳遞、擴散的區域，如果要精確計算樣品的物理吸附量，死體積值是準確採集數據的基礎。因為真空體積法的測量基礎是壓力，吸附量的計算基礎是理想氣體狀態方程，所以吸附質氣體在擴散過程中壓力差越大，則氣體絕對量計算越準確。 系統死體積越小，對壓力變化的靈敏度越高，吸附量計算越準確。換句話說，在同樣的條件下，系統死體積越小，則儀器測量精度越高。由於在氮吸附分析過程中，液氮是不斷揮發的，所以為保證精確計算吸附量，要對死體積進行控制、測量或校準。

（3）32位晶片及電路系統：採用全新32位晶片及電路系統，相比24位系統，壓力傳感器分析精度提升30倍以上，確保超低比表面測量的極致精度。

模數轉換器即A/D轉換器，簡稱ADC，它是把連續的模擬信號轉變為離散的數位訊號的器件。轉換精度就是解析度的大小，因此要獲得高精度的模/數轉換結果，首先要保證選擇有足夠解析度的ADC，同時還必須與外接電路的配置匹配有關。iPore系列不僅採用32位模數轉換，而且採用擁有自主智慧財產權的32位電路設計和製造，從系統上保證了壓力傳感器精度的進一步提升（見表1）。

表1   ADC晶片轉換精度與壓力解析度關係（以1000Torr傳感器為例）

ADC轉換位數	16 Bit	24 Bit	32 Bit
ADC有效位數	15 Bit	20 Bit	28 Bit
壓力最小解析度	2 Pa	0.0079 Pa	0.00003 Pa
壓力有效解析度	4 Pa	0.12 Pa	0.0039 Pa
*ADC有效位數是指可靠的轉換值

這些新技術的採用，帶來了意想不到的突破。它不僅可以用氮吸附測定0.005 m²/g左右的比表面積，大大超越了常規氮吸附的比表面下限極值（0.01m²/g），而且可以測得微量吸附下的孔徑分布（圖6）。

三、突破性吸附技術對製藥行業的應用意義

1. 超低比表面樣品測定的重複性、重現性和穩定性：

儀器的長期穩定性是低比表面材料樣品質量檢測和質量控制的基礎保證。為了驗證新技術的準確性和長期穩定性，使用氮氣測試比表面標準樣品(標稱值0.221±0.013m²/g，氪吸附)的重複性偏差（表2）。結果表明，iPore 400的即時重複性偏差優於0.1%，一天重複性偏差優於0.6%，四天長期穩定性優於1.0%！性能的全面優化使BET比表面測定長期重複性達到空前水平！

iPore 400可以配置6個獨立的分析站（圖4），具有極高的通量，不僅節省分析時間，提高了分析效率，而且6個站BET測定結果具有高度的一致性，重現性偏差同樣優於1%（表3）。

表3  低比表面石墨樣品比表面平行測定實驗（紅色數據是12次測量結果的標準差）

		BET比表面值（m2/g）,   R > 0.9999						六站測定重現性
測定次數	站號	1	2	3	4	5	6	RSD
1	定投氣量測試	0.8781	0.8880	0.8940	0.8825	0.8878	0.8800	0.54%
2	定壓測試	0.8767	0.8760	0.8747	0.8747	0.8744	0.8816	0.25%
同站測定重現性，RSD		0.07%	0.60%	0.96%	0.39%	0.67%	0.08%	0.61%

我們用這些新技術對薄膜超低比表面積進行了重複性測定，得到了相當出色的結果 (BET = 0.0307m²/g)。這為解決超濾膜和納濾膜的納米孔分析奠定了基礎（圖7）。

2. 超高比表面樣品測定的重複性：

共價有機框架聚合物（COF）是一種低密度、高比表面、易於修飾改性和功能化的新型人工合成材料。在問世的短短十餘年之間，就在氣體儲存與分離、非均相催化、儲能材料、光電、傳感以及藥物傳遞等領域展現出優異的應用前景，並且已經發展成為一種納米藥物載體。常規氣體吸附法比表面容易測定的範圍是5~500 m²/g之間。因為吸附量巨大，需要長時間的平衡條件，比表面大於1000 m²/g 的樣品重複性控制並不容易做到。為此，對比表面大於2000m²/g的COF樣品比表面進行了長期穩定性測定，結果重複性優於0.07%（圖8）！

3. 能力驗證——新技術對超低比表面樣品測定重複性的重要性：

為了比較新技術和現有技術在超低比表面應用中的區別，我們用一種極低比表面的金屬氧化物對儀器性能進一步進行了驗證，並與其它品牌的測試結果進行了比較（圖8）。結果表明，新技術不僅兩次測定（圖8a和b）相關係數都在0.9999以上，而且BET比表面和吸脫附等溫線都能很好地重複；而一旦關閉死體積恆定功能，雖然BET =0 .032並且相關係數（R=0.9987）依然滿足藥典0991要求（圖8c），但其數據質量已經迅速下降，脫附等溫線已經發生變形，說明這些採用的新技術相輔相成，缺一不可。而沒有這些技術的常規氮吸附分析儀器的噪音已經完全掩蓋了該樣品的微弱吸附量，無法分辨（圖8d）。

a和b：iPore 400兩次測定的結果，比表面積值可以完全重複；

c：iPore 400關閉死體積恆定功能的結果，可見BET回歸係數下降，脫附曲線受液氮揮發導致的死體積變化，已經完全變形 ；

d：其它品牌儀器所測的結果，吸附量被儀器本身的噪聲所掩蓋，等溫線顯示為儀器本底的隨機噪聲曲線

4. 在標準「介孔儀器」配置上實現氪吸附：

藥品多為有機化合物，比表面值一般都很低。新版中國藥典0991指出，對於比表面積小於 0.2m²/g 的供試品，為避免測定誤差，可選用氪氣作為吸附質；也可選用氮氣作為吸附質，但必須通過增加取樣量，使供試品總表面積至少達到 1m2方可補償測定誤差。氪氣（Kr）因其在液氮溫度下的飽和蒸汽壓特性，是用於小比表面積樣品的精密測試方法。但是，進行Kr吸附一般至少需要配備10torr的高精密壓力傳感器以及分子泵，以分辨P/P₀在10^-5~10^-4的極低壓力環境下細微的壓力變化，從而保證數據精確且穩定。氪吸附應用到小於0.05 m²的絕對表面積計算。

但是，一般的氪吸附的應用需要配置分子泵和10torr壓力傳感器，這給企業帶來了額外的成本負擔。而新技術的突破可以在標準配置（機械泵和1000torr壓力傳感器）的條件下滿足氪吸附的應用要求，P/P₀下限達到可重複的10^-5（圖9），為醫藥企業節約了檢測投資成本！

5. 用氮吸附完全替代氪吸附：

其實，在77.4K的氪吸附實際還存在著許多問題，如其吸附層的性質和熱力學狀態並不明確，是固體還是液體？應該參照何種狀態來計算P/P₀？與此連帶的一些問題是，在遠遠低於三相點溫度的環境下，氪作為被吸附相有怎樣的浸潤特性（因為在BET方法中，假設吸附質相完全浸潤）？在77K的氮吸附中，可以觀察到幾乎所有材料都被完全浸潤的特性，但在低於三相點溫度時，這種情況可能是不同的。 另一個不確定因素是氪分子的有效橫截面積，它非常依賴於吸附劑表面，因此沒有被很好地建立起來。從氪的過冷液體密度計算出的橫截面面積是0.152 nm² (15.2 ?²），但通常會用較大的橫截面面積值，甚至高達0.236 nm²（23.6 ?2）。採用較多的橫截面積值是0.202 nm²（20.2 ?²）。除此之外，氪氣的成本是氮氣的240倍，這意味著氪吸附測定需要高昂的實驗成本，會極大加重企業負擔。因此，理化聯科氣體吸附分析技術上的突破帶來了藥企行業應用的巨大突破，氮吸附已經成功地實現了氪吸附領域的超低比表面積測定（圖6~8）。我們用氮吸附成功測定的極限樣品是0.0047m²/g，這意味著只有當試樣比表面小於0.005m²/g時，才需要氪吸附，而這樣的樣品鳳毛麟角。也就是說，一臺全部採用上述新技術的儀器可以全部滿足藥企各種比表面的測定需求。

6. 建立超濾膜孔徑（納米孔）評價的新方法：

濾膜孔徑評價的經典方法是氣體滲透法（即毛細管流動法），但這種方法的適用範圍是20nm~500μm。超濾膜是一種孔徑範圍為1-20nm的納米孔過濾膜，其範圍恰恰在氣體滲透法能力之外。該膜的孔徑範圍雖然被氣體吸附法所覆蓋，但由於膜的吸附量過低，常規的氣體吸附法無法實現測定。國外曾經建立起了液氬溫度下氪吸附測量膜孔徑的方法，但無論儀器、耗材及方法都很難向工廠推廣。製藥行業中膜技術應用存在的技術瓶頸亟待解決，需要建立快速可行的超濾膜孔徑評價方法。實際上，電池隔膜和電子薄膜也存在類似問題。

氣體吸附技術在精度控制上的突破也為納米薄膜的孔徑分布分析帶來佳音，這種吸附量極低的孔徑分析不再需要液氬溫度下的氪吸附，只需要按照常規操作即可（圖6右）。

7. 突破傳統「介孔儀器」，實現微介孔樣品的氮吸附微孔測定：

新的氣體吸附技術標準使1000torr傳感器的解析度提高到了10torr級別，儀器的密封性使機械泵抽空效率發揮到極致。以氮吸附替代氪吸附，以傳統介孔儀器成功測定微孔（圖10），不僅節約了用戶購買儀器的成本，而且降低了用戶使用成本；不僅將比表面測定的重複性提高一個數量級，而且微孔分析的重複性也得到充分保障，對MOF/COF樣品的研究開發將起到推動作用。

8. 氣凝膠較大介孔和邊際大孔的孔徑分析取得突破：

氣體吸附法介孔孔徑分析的經典方法是BJH法，它是基於以毛細管凝聚理論為基礎的KELVIN公式。其基本概念是，當壓力增加時，氣體先在小孔中凝結, 然後才是大孔。因此，孔徑與壓力有對應關係。但是，當孔徑大於10nm以後（對應P/P₀=0.90），壓力上升0.05（P/P₀=0.95），對應的孔徑已經是20nm了，並且呈指數上升。如：P/P₀=0.98對應50nm，而0.99則已經是100nm了。因此，雖然ISO15901-2指出氣體吸附法的孔徑測定上限是100nm，但實際上很少有人能做到30nm以上去，因為壓力傳感器必須能夠密集分辨和探知百萬分之一的壓力變化，這大大超出了常規壓力傳感器0.15% 解析度的標稱值。

氣凝膠是一種新型低密度多孔納米材料，具有獨特的納米級多孔及三維網絡結構，同時具有極低的密度（3?500kg/m³）、高比表面積（200?1000m²/g）和高孔隙率（孔隙率高達 80?99.8％，孔徑典型尺寸為 1?100nm），從而表現出獨特的光學、熱學、聲學及電學性能，具有廣闊的應用前景。在醫藥領域，氣凝膠被用於藥物可控釋放體系。但是，其孔徑分布分析卻遇到麻煩，因為壓汞儀的高壓會破環樣品的孔結構。

致病微生物在多孔氧化鋁膜上生長不易受到限制，因此氧化鋁膜常用於藥物敏感性實驗（DST）了解病原微生物對各種抗生素的敏感程度或耐受程度來指導臨床用藥。與氣凝膠相反，膜的單位吸附量極低，但孔徑可能達到100nm以上。

由表1可知，32位電路新技術可以極大地提高壓力傳感器的解析度，至少可分辨3.9*10^-8的相對壓力變化，因此，我們嘗試對氣凝膠和氧化鋁膜進行孔徑分布分析。利用精細投氣控制新技術，0.99以上的設點間隔達到0.0002的密度，最高吸附點達到了0.9980（對應孔徑559nm），在測試方法上取得新的突破，為建立氣凝膠和氧化鋁膜孔徑分析的新方法奠定了堅實的基礎（圖11）。

四、總結

工欲善其事，必先利其器!

利用氣體吸附分析儀進行比表面積質量控制分析時，經常碰到如下問題：不同廠家儀器之間數據不一致；同一型號在不同地域或不同海拔的數據不一致；同一臺儀器在白天晚上或春夏秋冬的數據不一致；同一臺儀器長期穩定性不好。這些現象已經成為長期困擾行業質量控制的頭疼問題。氣體吸附分析技術的突破不僅徹底攻克了這個難題，而且使超低比表面分析達到高穩定性、高重複性、高效率；隨之產生的功能性擴展，無論用氮吸附代替氪吸附，還是孔徑分布測定向介孔兩端範圍延伸拓展，都為中國企業全面貫徹中國藥典0991帶來了超高性價比的驚喜！

氣體吸附分析技術的突破，為全面貫徹藥典新規和GB/T 19587-2017標準，準確測定原料藥、藥用輔料及其產品的比表面和孔徑，進行精確的質量控制或檢驗，提供了性能全面優化的可涵蓋各種藥用試品的分析儀器，也為下一代物理吸附分析儀的發展方向樹立了新的標杆，建立了新的標準。

作者簡介：

（註：本文由楊正紅老師供稿，不代表儀器信息網本網觀點）