溫度可調節每個細胞內的生化反應，是細胞的關鍵物理參數。測試活細胞的溫度，特別是病變細胞非常重要，例如炎症細胞和腫瘤細胞，它可以提供關於病理學和生理學的意見，有助於精確診斷和治療。目前，許多方法可以檢測細胞內溫度，包括掃描探針顯微鏡，納米級測溫法，羅馬光譜法。但是，這些現有方法都有許多缺點，如靈敏度低、受化學環境和周圍介質的光學特性影響等。近期，唐本忠團隊在《JACS》上發表「Multicolor Tunable Polymeric Nanoparticle from Tetraphenylethylene-Cage for Temperature Sensing in Living Cells」.作者以聚集誘導發光分子四苯基乙烯（TPE）為引發劑，通過原子轉移自由基聚合（ATRP）合成兩親（N異丙基丙烯醯胺）（PNIPAM）聚合物（CNP）（流程1）。在水性介質中，兩親CNP自組裝成納米顆粒，並可以通過添加染色劑4-Dimethylamino 2'-butoxychalcone（DMBC，黃色發光）和尼羅河紅（NR，紅色發光）來調整其發射。基於螢光團之間的能量轉移（FRET），通過協調這些螢光團的質量比，系統發光顏色改變。由於PNIPAM中異丙基之間的疏水相互作用與醯胺和水的氫鍵作用，CNP上的PNIAM會根據溫度而收縮或延伸。因此，可逆的空間變化可調節螢光團的距離或苯環的分子內運動，FRET強度改變，最終實現熱致變色。這種生物兼容的熱響應材料可靈敏的探測細胞內溫度。
流程1.PNIPAM聚合物（CNP）合成示意圖。
1、TC1的結構
如圖1 所示，TC1是兩個螺旋槳狀TPE，由四個三嗪單元固定，形成一個四方稜柱結構，體積約為9.4×7.0×5.6Å3。由於TPE單元由三嗪單元固定，TPE單元上苯環的旋轉和振動受空間效應的限制，這使輻射衰減過程變得更為重要，因此，溶液中TC1具有螢光性質。
圖1.TC1的X射線晶體結構的化學結構（a），俯視圖（b）和側視圖（c）。
2、PNIPAM聚合物組裝成溫敏納米顆粒
PNIPAM是典型的溫敏聚合物（較低臨界溶液溫度（LCST）為32℃），用N-（2-氨基乙基）-2-溴-2-甲基丙醯胺修飾TC1來合成引發劑TC2。當TC2與800當量NIPAM在DMSO / i-PrOH中在室溫下合成兩親CNP，CNP可以在水中組裝成納米顆粒，其中疏水TPE聚集，而親水PNIPAM在室溫下延伸到水中。濃度為0.5mg / ml時，CNP納米顆粒在水中的流體動力學直徑（Dh）為153 nm（圖2a），TEM圖像中的尺寸為50-100 nm（圖2b）。CNP的臨界凝膠化濃度（CGC）為1.5 wt％（圖3c）。通過使用DLS和UV / vis光譜儀檢測，溶液濁點為33°C，這通常與其他PNIPAM衍生物的LCST相同（?32°C；圖2d）。
圖 2.CNP DLS分布圖(a)和TEM圖像(b),(c)TPE-PNIPAM溶液在20°C及50°C的照片,(d)CNP透射率和粒徑與溫度的關係
3、通過福斯特共振能量轉移（FRET）調整多色發光
與一步能量轉移相比，由三個或更多的螢光團組成的供體和受體發色團之間的級聯FRET具有更強的Stokes 位移和顏色發光。根據受體的激發波長與供體的發射波長重疊原理，作者選擇黃色發色團4-Dimethylamino-2'-butoxychalcone（DMBC）和紅色發色團尼羅紅（NR）作為供體或受體。添加DMBC的變化後，CNP的螢光強度逐漸降低，添加NR的變化時，DMBC的強度也逐漸降低，這證實了從CNP到DMBA再到NR的有效兩步FERT。通過向CNP水溶液中加入不同劑量的DMBC和NR（0.5 mg / mL），可以將雜合納米顆粒的螢光色調整為全色（圖3）。當mCNP∶mDMBC∶mNR的質量比為1：6.40×10-3：2.24×10-3時，雜化納米粒子的螢光可調成白光。
圖3.添加DMBC和NR後，CNP的螢光譜圖（a），螢光顏色變化（b）和紫外燈下的照片（c）。
由於CNP的可逆溫度敏感性，雜化納米粒子的螢光色具有可逆溫敏。加熱至45°C後，白色發光轉換為橙色發光，冷卻至室溫後發光可恢復至白色（圖4b和4c），37°C左右的溫度解析度至少為0.5°C。作者以兩個過程來描述螢光顏色變化現象：1）在LCST以下，雜化納米顆粒的螢光顏色略有變化。升溫加速苯環的旋轉和振動，螢光衰減，級聯FRET效應會間接降低DMBC（530 nm）和NR（620 nm）的螢光強度。2）當溫度達到LCST時，雜化納米粒子的螢光進一步明顯變為橙色。隨著PNIPAM收縮，螢光團TC1，DMBC和NR將距離變近，三種螢光團之間的級聯FRET效率提高。圖4a中，在490 nm處的峰是TC1（450 nm）和DMBC（530 nm）的疊加，紅色移至520 nm，這是因為更多的能量從螢光團TC1轉移到DMBC。在25和45°C下，TC1對DMBC的FRET效率分別為63％和79％；TC1和DMBC組合對NR的FRET效率分別為57％和85％。因此，在25°C和45°C下，該系統的整體FRET效率分別為36％和70％。
圖4.(a)納米粒子在不同溫度下發射白光的螢光光譜，以及納米粒子可逆熱致變色的螢光光譜(b)和相關CIE圖(c)。
4、通過顏色變化檢測細胞溫度
作者將白光發射雜化納米顆粒（WCNP）作為細胞內溫度探針引入細胞中。WCNPs具有良好的生物相容性，在HeLa細胞中未檢測到細胞毒性（圖5a），且WCNP在整個細胞質中分布（圖5b）。25°C時重疊的圖像顯示出白光發射，與溶液中的WCNP相似，表明它們在細胞質中穩定組裝。隨著將溫度從25°C升高到45°C，450-530 nm之間的螢光強度降低，而620 nm處的螢光強度增加，螢光顏色從白色變為紅色。作者還用流式細胞儀定量分析細胞內螢光強度的變化。如圖5c所示，隨著溫度的升高，NR與CNP的螢光強度之比（ICNP / INR）及NR與DMBC的螢光強度之比（IDMBC / INR）均隨溫度的升高而增加。這些結果都表明WCNPs是理想的細胞內溫度探針。
圖5.(a)雜合納米顆粒在HeLa細胞中的MTT分析,(b)以及在不同溫度下的共聚焦顯微鏡圖像,(c)不同溫度下螢光變化
結論
作者提出了一種通過ATRP合成基於TPE的聚合物CNP的方法。通過級聯FRET將客體染料封裝到疏水域中，可調整CNP的螢光色，這為在水性溶液中構建全光譜發光雜化納米粒子提供了一種簡單的方法。此外，通過利用CNP的溫度敏感性，該雜化納米顆粒可以用作細胞溫度探針。該螢光探針不僅具有易讀取和高解析度的特點，還可避免繁瑣的合成，具有成本效益。
參考文獻：doi.org/10.1021/jacs.9b11544
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