原創：湯波 我是科學家iScientist
作者：湯波
編輯：Yuki
昨天，諾貝爾化學獎正式揭曉，能榮獲一次諾貝爾獎，可謂是科學家科研生涯的巔峰時刻。由於種種原因，一些做出重大科學發現的科學家遺憾地與諾貝爾獎擦肩而過，也有一些幸運的科學家卻兩次獲得諾貝爾獎，當然後者屬於「鳳毛麟角」。
迄今為止，全世界兩獲諾貝爾獎的科學家只有四位，包括獲得諾貝爾物理學獎和化學獎各一次的波蘭裔法國科學家瑪麗·居裡，兩獲諾貝爾物理學獎的美國物理學家約翰·巴丁，獲得諾貝爾化學獎和和平獎各一次的美國化學家萊納斯·鮑林，以及今天我們要介紹的弗雷德裡克·桑格（Frederick Sanger）。
弗雷德裡克·桑格 | Wikimedia Commons
1988年，70歲的桑格在《生物化學年鑑》上發表了一篇長達28頁的文章，文章題目是《序列，序列，還是序列》，高度概括了自己的科研生涯。桑格的一生，的確與生命大分子序列的解密有著不解之緣，先是首次測定了蛋白質的序列，後來又發明了RNA和DNA測序的新方法，因此成為唯一兩獲諾貝爾化學獎的科學家。
用「拼圖遊戲」解讀蛋白質1918年，桑格出生在英國西南部一個小鄉村裡，父親是名醫生，曾經作為傳教士到過中國，母親出生於富裕的棉商家庭。受父母影響，桑格從小對科學非常感興趣，高中時就立志要從事科學研究。
11歲的桑格(中)和哥哥、妹妹生活在一起 | achievement.org
18歲那年，桑格進入劍橋大學學習自然科學，在生物化學方面表現出色，但是數學和物理勉為其難。1940年，桑格繼續在劍橋大學攻讀博士學位，主要研究動物體內的賴氨酸（一種胺基酸）代謝，3年後獲得博士學位。
博士畢業後，桑格進入劍橋大學生物化學系查理斯·齊布納爾（Charles Chibnall）教授實驗室。齊布納爾教授已在牛胰島素的結構方面做了很多研究，他建議桑格去破解牛胰島素的胺基酸組成。這是極富挑戰性的研究，因為當時科學家已知道蛋白質是由20種胺基酸組成的，就像一些顏色不同的海洋球串聯在一根繩子上，但是大家並不知道這些胺基酸到底是如何排列的，甚至以為蛋白質並沒有固定結構。
齊布納爾和桑格之所以選擇將牛胰島素作為研究對象，主要是因為牛胰島素是當時少數幾種容易獲取的高純度蛋白質之一，結構也相對簡單，只有51個胺基酸，關鍵它還是治療糖尿病的標準藥物。
這項研究就像是給桑格預留的一樣，很快，桑格就找到突破口。大多數小朋友都玩過拼圖遊戲，一個有漂亮圖案的紙板被分割成形狀各異的小紙片，小朋友很快就能根據不同小紙片形狀來拼接成完整的圖形，桑格正是想到了拼圖遊戲。
桑格和胰島素模型 | achievement.org
桑格先採用化整為零的策略，用蛋白酶將牛胰島素切成多肽小段，再把一種特殊有機染料結合到多肽段的末端胺基酸上，然後讓這個標記有染料的胺基酸脫落下來，讓這些脫落的胺基酸在帶電極的試紙上「賽跑」，通過與已知的胺基酸進行比較，可以確認它們是哪種胺基酸。
重複這樣的試驗，就能將每個多肽小段的胺基酸序列測出來，然後拼圖遊戲開始，將已確認序列的多肽段進行序列比對，確認它們的前後順序。這樣，牛胰島素的胺基酸序列就全部弄清楚了。
最後，桑格發現胰島素由兩條多肽鏈組成，一條含有21個胺基酸（A鏈），另一條含有30個胺基酸（B鏈），兩條多肽鏈之間通過由兩個硫原子組成的鏈條連接在一起。
這是科學家第一次測定蛋白質的胺基酸組成，也是第一次知道蛋白質有自己特有的結構，開啟了人類認識蛋白質這一生命大分子的徵程，並為DNA遺傳密碼的發現奠定了基礎。
多年瓶頸，他轉向核酸測序自從1955年破解了牛胰島素的序列之後，桑格的科研生涯突然陷入了長達10年的瓶頸期。或許是為盛名所累，或許是自己的創新源泉業已枯竭，在這10年裡，桑格幾乎沒有產出什麼自己瞧得上眼的科研成果，他把這段時間稱為「貧瘠年代」（Lean Years）。
桑格在1958年的諾貝爾獎慶典上 | bioc.cam.ac.uk
1962年，原本在英國醫學研究理事會工作的桑格，進入新成立的分子生物學實驗室。該實驗室由諾貝爾化學獎得主馬克斯·佩魯茨（Max Perutz）擔任首位主任，弗朗西斯·克裡克（Francis Crick）和西德尼·布倫納（Sydney Brenner）等核酸研究專家也加入其中，桑格負責這個實驗室中蛋白質化學實驗室的工作，計劃繼續進行蛋白質結構方面的研究。
由於經常與克裡克和布倫納等分子生物學家接觸和交流，桑格意識到DNA和RNA才是生命科學的未來，開始涉足這一領域，不過仍然把關注點放在自己的老本行——測序。當時，科學家剛剛將遺傳密碼等基礎問題弄明白，核酸序列測定仍然是個世界難題。
桑格在觀察一個DNA分子模型 | achievement.org
桑格很快發現，RNA和DNA的序列並不比蛋白質的好測，因為這些核酸分子特別是RNA極不穩定，當時也很難獲得高純度的核酸樣品。1965年，美國康奈爾大學的生化學家羅伯特·霍利（Robert Holley）採用類似蛋白質測序「化整為零」的方法，測定了一個只有77個鹼基的酵母轉運RNA序列。這算得上第一個被測定序列的核酸分子，霍利接著闡明了轉運RNA的空間結構，填補了細胞中DNA轉錄成信使RNA後將胺基酸組裝成蛋白質的關鍵環節，因此與尼倫伯格和霍拉納一起分享了1968年的諾貝爾獎生理學或醫學獎。不過，霍利的測序方法非常麻煩，而且效率低下。
桑格對蛋白質合成過程中核酸的作用也有濃厚興趣，在霍利測出轉運RNA的序列不久，桑格和他的博士後建立了一個基於同位素P（磷）-32放射自顯影技術的RNA測序方法，成功測定了大腸桿菌中一個大小為120個鹼基的核糖體RNA的序列，效率比以前的方法大幅提高，這一方法也為DNA測序帶來了靈感。
成為「經典」的桑格DNA測序法很快，桑格又將目光聚焦到更重要的核酸分子DNA上，不過DNA測序方法與RNA的截然不同，一方面因為DNA序列都比較長，比如一種簡單的噬菌體病毒φX174就有5000多個鹼基，如果按照以前的蛋白質和RNA測序方法，工作量實在太大；另一方面缺乏合適的DNA酶，特別是缺乏可切割單個脫氧核苷酸的酶。
顯然，DNA測序並不適合用「減法」，那麼「加法」行不行呢？
20世紀70年代初，康奈爾大學的華人科學家吳瑞等人建立了一種位置特異引物延伸測序法，即在引物（一段與單鏈DNA末端互補的寡核苷酸）的引導下，DNA聚合酶能在試管內以單鏈DNA為模板，將4種游離的脫氧核苷酸（A、T、C和G）組裝成互補鏈，形成雙鏈DNA。如果依次加入這4種脫氧核苷酸，就可測定DNA模板上引物序列之後的每個鹼基是什麼，從而完成DNA測序。不過這種方法費時費力，效率極低，不適合進行長片段DNA測序。
在此基礎上，經過多年摸索，桑格帶領他的博士後發明了雙脫氧終止測序法。他們準備了4個試管，每個都加入待測序的模板DNA、DNA聚合酶、寡核苷酸引物單鏈DNA和4種脫氧核苷酸，但是在每個試管中，這4種脫氧核苷酸中分別有一種會被標記上同位素P-32。當DNA聚合酶催化DNA鏈延伸反應時，一旦加入同位素標記的脫氧核苷酸，反應就會立即停止，利用凝膠電泳和放射自顯影技術，即可輕鬆檢測出鏈延伸反應在什麼脫氧核苷酸上終止的，以此類推，整個模板DNA的序列就能被測出。
1977年，桑格和博士後用這一方法測定了噬菌體病毒φX174的基因組序列，長度為5386個鹼基，這是人類第一次測定一個生物體完整的基因組。1980年，桑格與沃爾特·吉爾伯特（Walter Gilbert）和保羅﹒伯格（Paul Berg）一起分享了諾貝爾化學獎，成為歷史上唯一一位兩次榮獲諾貝爾化學獎的科學家，也是4位兩次獲得諾貝爾獎的獲獎者之一。
1980年，桑格第二次參加諾貝爾頒獎典禮 | dnalc.cshl.edu
桑格為人謙和，稱自己「只是個把實驗室搞砸的傢伙」，「在學術上並不輝煌」。他曾拒絕英國王室授予的爵士稱號，因為他並不想因此與眾不同。1983年，65歲的桑格正式退休。2013年11月19日，桑格在劍橋的一家醫院於睡夢中與世長辭。
為了紀念桑格，人們將雙脫氧終止測序法稱為「桑格測序法」。這一方法很快被廣泛用於測定各種功能基因和各種生物基因組的序列，更為人類基因組計劃的啟動和完成奠定了重要基礎。
作者名片
排版：陳小磚
題圖來源：achievement.org
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