測定蛋糕中的菌落總數可以用來判定其被微生物汙染的程度及衛生質量，它反映蛋糕在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價，菌落總數的多少在一定程度上標誌著蛋糕產品質量的優劣，因此，測定蛋糕中的菌落總數具有重要意義。
蛋糕具有鬆軟香甜，攜帶方便、食用簡單等特點，因此成為人們居家生活特別是旅途中不可或缺的一種美食，深受人們的喜愛。目前應用於測定食品中菌落總數的方法有: 紙片法、電阻抗法等。本實驗採用國標法(GB\T 4789.2-2010)對獨立包裝小蛋糕中菌落總數進行測定。並與GB 7099-2003糕點、麵包衛生標準中規定的冷加工糕點中菌落總數≤10000（cfu/g）的數據對比初步判斷樣品是否符合衛生要求。
一、實驗目的
1、學習並掌握測定蛋糕中菌落總數的方法及原理。
2、通過對比實驗驗證冷藏對蛋糕的保鮮及抑菌作用。
3、了解菌落總數測定在食品衛生學評價中的意義。
二、實驗原理
菌落總數即為食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養後，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。
菌落總數主要作為判定食品被汙染程度的標誌，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖動態，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。每種細菌都有它一定的生理特性，培養時應用不同的營養條件及其他生理條件（如溫度、培養時間、pH、需氧性質等）去滿足其要求才能將各種細菌都培養出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法。細菌菌落總數的測定，所得結果，只包括一群能在營養瓊脂上發育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數。菌落總數並不表示樣品中實際存在的所有細菌總數，菌落總數並不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。
三、實驗設備與材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
3.1 恆溫培養箱：36 ℃±1℃，30℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恆溫水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量為0.1 g。
3.5 均質器。
3.6 振蕩器。
3.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
3.8 無菌錐形瓶：容量250 mL、500 mL。
3.9 無菌培養皿：直徑90 mm。
3.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
3.11 放大鏡或/和菌落計數器。
3.12範記原味蛋糕，烘烤類糕點（冷加工），執行標準（GB/T 20977）
四、 試劑和培養基及其製備
4.1 平板計數瓊脂培養基
4.1.1成分:胰蛋白腖 5.0 g;酵母浸膏 2.5 g;葡萄糖 1.0 g;瓊 脂 15.0 g;蒸餾水 1000 mL pH 7.0±0.2
4.1.2製法:將上述成分加於蒸餾水中，煮沸溶解，調節pH。分裝試管或錐形瓶，121 ℃高壓滅菌15 min。
4.2 磷酸鹽緩衝液
4.2.1 成分:磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g;蒸餾水 500 mL;pH 7.2 4.2.2 製法 貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶於500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL後貯存於冰箱。 稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL，分裝於適宜容器中，121 ℃高壓滅菌15 min。
4.3 無菌生理鹽水
4.3.1 成分:氯化鈉 8.5 g;蒸餾水 1 000 mL
4.3.2 製法稱取8.5ｇ氯化鈉溶於1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。
五、實驗步驟
5.1採樣
5.1.1在南寧市範記餅屋採購生產日期為當天的同批次的範記原味蛋糕，樣品為即食類預包裝食品,採樣時，取相同批次的最小零售原包裝，檢驗前要保持包裝的完整，避免汙染[3] 。
5.1.2採集樣品的標記 應對採集的樣品進行及時、準確的記錄和標記，採樣人應清晰填寫採樣單（包括採樣人、採樣地點、時間、樣品名稱、來源、批號、數量、保存條件等信息）[3] 。
5.1.3 採集樣品的貯存和運輸 採樣後，應將樣品在接近原有貯存溫度條件下儘快送往實驗室檢驗。運輸時應保持樣品完整。如不能及時運送，應在接近原有貯存溫度條件下貯存[3] 。
5.1.4 樣品處理 實驗室接到送檢樣品後應認真核對登記, 確保樣品的相關信息完整並符合檢驗要求。實驗室應按要求儘快檢驗。若不能及時檢驗，應採取必要的措施保持樣品的原有狀態，防止樣品中目標微生物因客觀條件的幹擾而發生變化[3] 。
5.2檢驗員分組
實驗時檢驗員分A、B、C三大組，每大組再分別分為三個小組，各組分工如下： A組測打開包裝後4℃保存5h的樣品，A1、A2、A3三個小組分別測三個不同稀釋度樣品 B組測打開包裝後常溫下存放5h的樣品，B1、B2、B3三個小組分別測三個不同稀釋度樣品 C組做空白對照實驗。
5.3樣品的製備與稀釋
5.3.1試樣的前處理
進入無菌室後，先打開酒精燈，用酒精棉球擦試手及樣品外包裝，如為原包裝，用滅菌鑷子夾下包裝紙，採取糕點不同部位的樣品25g 置入盛有225 mL 的滅菌生理鹽水的無菌均質杯內，8000~10000 r/min 均質1~2 min，製成1∶10 的樣品勻液。
5.3.2用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注於盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支無菌吸管反覆吹打使其混合均勻，製成1:100 的樣品勻液。
5.3.3 按5.4.2 操作程序，製備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。
5.3.4根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2 個～3 個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10 倍遞增稀釋時，吸取1 mL 樣品勻液於無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL 空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。
5.3.5及時將 15 mL～20 mL 冷卻至 46 ℃的平板計數瓊脂培養基（可放置於 46 ℃±1 ℃恆溫水浴箱中保溫）傾注平皿，並轉動平皿使其混合均勻。
5.4培養 5.4.1 由於糕點樣品中可能含有在瓊脂培養基表面瀰漫生長的菌落[2] ，因此待瓊脂凝固後，在凝固後的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4 mL），凝固後翻轉平板，36 ℃±1 ℃培養48 h±2 h。
5.5菌落計數 可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。
5.5.1 選取菌落數在30 CFU～300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30 CFU 的平板記錄具體菌落數，大於300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應採用兩個平板的平均數。
5.5.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜採用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板後乘以2，代表一個平板菌落數。
5.5.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。
六、結果與報告
6.1 菌落總數的計算方法
6.1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。
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