6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品置盛有225mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內, 8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入有225mL稀釋液的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,製成1∶10的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,製成1∶10的樣品勻液。
6.1.3 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注於盛有9mL稀釋液 的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支無菌吸管反覆吹打使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
6.1.4 按6.1.3 操作,製備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1 次1 mL 無菌吸管或 吸頭。
6.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在 進行10倍遞增稀釋時,吸取1mL 樣品勻液於無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。同時,分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。
6.1.6 及時將15mL~20mL冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基(可放置於46 ℃±1 ℃恆溫水浴箱中保溫)傾注平皿,並轉動平皿使其混合均勻。
6.2 培養
6.2.1 待瓊脂凝固後,將平板翻轉,36 ℃±1培養48h±2h。水產品30 ℃±1 ℃培養72h±3h。
6.2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面瀰漫生長的菌落時,可在凝固後的瓊脂表面覆蓋一薄層 瓊脂培養基(約4mL),凝固後翻轉平板,按6.2.1條件進行培養。
6.3 菌落計數
6.3.1 可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。
6.3.2 選取菌落數在30CFU~300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30CFU 的平板記錄具體菌落數,大於300CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應採用兩個平板的 平均數。
6.3.3 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜採用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋 度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其餘一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板後乘以 2,代表一個平板菌落數。
6.3.4 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。