用共價鍵提高CRISPR/Cas9的修復效率

2020-11-28 科學網

論文標題：Increasing Cas9-mediated homology-directed repair ef?ciency through covalent tethering of DNA repair template

期刊：Communications Biology

作者：Wendy R. Gordon et al

發表時間：2018/05/31

數字識別碼：10.1038/s42003-018-0054-2

原文連結：https://www.nature.com/articles/s42003-018-0054-2?utm_source=Other_website&utm_medium=Website_links&utm_content=RenLi-Nature-Communications_Biology-Biochemical_Research_Methods-China&utm_campaign=NEWCOMMS_USG_JRCN_RL_sciencenet_Cas9_Aug_2nd

近日在《通訊-生物學》發表的一項名為Increasing Cas9-mediated homology-directed repair ef?ciency through covalent tethering of DNA repair template的研究，描述了美國明尼蘇達大學基因工程中心的Wendy Gordon 的團隊發現的能夠增加Cas9介導的同源定向DNA 修復的效率的研究。

CRISPR/Cas9是有力的基因組編輯工具。研究者們已經成功地找出用CRISPR/Cas9系統把基因關閉、啟動或者修復的方法。但是因為CRISPR/Cas9系統的準確率不穩定，所以專家們在把其應用在眾多疾病，比如X染色體斷裂症候群，鐮狀細胞貧血，亨廷頓疾病的臨床治療上一直持保守態度。研究者們也發現，不同的引導DNA，不同的靶基因，基因組裡不同的區域，不同的細胞系，或者取自不同器官、組織、或者病人的細胞裡，CRISPR/Cas9系統的成功率也大有不同。雖然有些環境會讓CRISPR/Cas9的成功率高達近100%，但是多數的環境會導致很低甚至近於零的成功率。所以研究者們已經著手研究增加CRISPR/Cas9的成功率的策略，比如改變Cas9蛋白質的結構，加入其他的DNA 片段來幹擾細胞原有的DNA修復功能等等。但是這些策略仍然會受細胞種類或者靶基因在基因組裡的位置的影響。

在現有的系統裡，雖然Cas9 蛋白質和引導DNA通常是被包裝在一起送入靶細胞，但是它們之間沒有共價鍵。以前已經有研究團隊顯示，把引導DNA和一個與Cas9相似的被改進的蛋白質用共價鍵結合，會增加其同源定向DNA的修復的效率。但是那個方法的工序過於複雜和昂貴。

於是Wendy Gordon的團隊想尋找另外一個把引導DNA用共價鍵和Cas9結合，以增加CRISPR/Cas9的系統的效率的策略。他們之前發現，HUH內切酶和單鏈DNA之間能夠容易並快速地形成磷酸酪氨酸鍵。於是他們設計和製造了一個HUH內切酶和Cas9的融合蛋白，然後證明這個融合蛋白能夠和單鏈DNA形成共價鍵。他們的研究顯示，這個融合蛋白和也是單鏈的引導DNA的複合體能夠把同源定向修復的成功率增加30倍。他們的初步數據顯示，這個策略不會受到細胞種類或靶基因在基因組裡的位置的影響。而且這個方法比之前的方法更簡潔和低成本。

Wendy Gordon的團隊希望以這個策略為增加CRISPR/Cas9系統的效率做出貢獻。

摘要：The CRISPR-Cas9 system is a powerful genome-editing tool in which a guide RNA targets Cas9 to a site in the genome, where the Cas9 nuclease then induces a double-stranded break (DSB). The potential of CRISPR-Cas9 to deliver precise genome editing is hindered by the low efficiency of homology-directed repair (HDR), which is required to incorporate a donor DNA template encoding desired genome edits near the DSB. We present a strategy to enhance HDR efficiency by covalently tethering a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) to the Cas9-guide RNA ribonucleoprotein (RNP) complex via a fused HUH endonuclease, thus spatially and temporally co-localizing the DSB machinery and donor DNA. We demonstrate up to a 30-fold enhancement of HDR using several editing assays, including repair of a frameshift and in-frame insertions of protein tags. The improved HDR efficiency is observed in multiple cell types and target loci and is more pronounced at low RNP concentrations.

閱讀論文全文請訪問：https://www.nature.com/articles/s42003-018-0054-2?utm_source=Other_website&utm_medium=Website_links&utm_content=RenLi-Nature-Communications_Biology-Biochemical_Research_Methods-China&utm_campaign=NEWCOMMS_USG_JRCN_RL_sciencenet_Cas9_Aug_2nd

期刊介紹：Communications Biology is an open access journal from Nature Research publishing high-quality research, reviews and commentary in all areas of the biological sciences. Research papers published by the journal represent significant advances bringing new biological insight to a specialized area of research.

（來源：科學網）

 

 

 

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