掌握這些Flowjo技巧,幫你輕鬆搞定流式數據

FlowJo是一款優秀的流式細胞分析專業軟體，可以兼容幾乎所有流式儀器採集的數據。它簡單易用，功能強大，是流式領域最受推薦的一款專業分析軟體，也是各高影響力科學期刊使用最多的軟體，已經成了行業的一個標準。

FlowJo 動力學平臺可以創建在收集時間的單個樣本的變化模型，從而得到時間與樣本相關參數的統計量的關係圖。實際應用中，用戶可以利用 FlowJo 分析鈣流數據，得出全部藥物處理過程中鈣離子通道變化的情況。

拖入凋亡樣本，雙擊原始數據打開圖形窗口。X軸選擇FSC-A，Y軸選擇SSC-A。分析凋亡的細胞選擇上圖所示的細胞群體進行分析。細胞碎片不予分析。

在SSC/FSC圖中雙擊「分析的細胞群體」，X軸選擇FITC,用來表示AnnexinV-FITC。Y軸選擇PE-Texas,用來表示PI。用四分門設門工具界定活細胞和凋亡細胞。如下圖所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區域的細胞為壞死細胞。也可能有少數的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。

Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此區域的細胞為晚期凋亡細胞。

Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區域的細胞為活細胞。

通常統計細胞凋亡率時採用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV陽性群）。

細胞周期的檢測是流式細胞儀最為廣泛的應用之一。細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親代分裂結束到子細胞分裂結束所經歷的過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細胞在G1期完成必要的生長和物質準備，在S期完成染色體DNA的複製，在G2期進行必要的檢查和修復，以保證DNA複製的準確性。在M期完成遺傳到子細胞中的均等分配，使細胞進行分裂。

細胞周期檢測中PI最為常用。PI為插入性核酸螢光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的鹼基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關係，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。

以cell cycle 文件夾中的5206.001，PI標記為例，設門選取目標細胞群體，將細胞碎片排除在外。即雙擊工作檯中的5206.001樣本，打開圖形窗口。X軸選擇FSC-H，Y軸選擇SSC-H，細胞碎片位於左下角的位置，設門選中目標細胞，如下圖：

設門選中要進行細胞周期分析的單細胞群體，排除粘連細胞（粘連在一起的雙細胞或多細胞團塊等）的影響。X軸選擇FL2-W(width)，Y軸選擇FL2-A(area)，設門方式如下圖：

BD的流式儀採集的數據：在進行周期分析的時候，通常是採用FL2-A與FL2-W（或者FL2-A與FL2H）進行設門。

Beckman的流式儀採集的數據：X軸選擇FL3-LIN,用來表示PI的線性信號。Y軸選擇FL3-PEAK,用來表示PI的峰值信號。設門方式如下圖：

在FlowJo工作檯中選中「單細胞群體」這個節點，在菜單欄的「工具」中選擇「細胞周期」，打開周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期細胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等數據。

圖中粉色的曲線是周期擬合的模型曲線，黑色的為樣本曲線。理想狀況是粉色和黑色曲線吻合一致為最佳。擬合的好壞可以根據右邊的RMS值來判斷。RMS(root mean square error)值越小越好，當周期擬合的不好的時候，可以通過更換擬合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或者更改限制條件確保（G1是G2的兩倍）進行調整。

而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期細胞所佔的百分比。G1/G2均數：G1/G2期細胞螢光強度的平均數。CV（Coefficient of Variation，變異係數）：儀器因素和樣品製備及染色過程對標本的人為影響。通常G0/G1峰的CV來檢測解析度或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的變異係數，其大小反映了G1/G2峰的寬度，數值越小，峰越窄。

 

FlowJo處理流式數據簡單易學，而且TOP10 免疫學期刊上的文章大多數都是用 FlowJo 分析數據。使用好FlowJo對發高分文章會有很大的幫助。

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