程亦凡談冷凍電鏡技術發展——訪美國加州大學舊金山分校副教授...

　　如果在兩年前，我們說冷凍電鏡(cryo-EM)是結構生物學研究的重要工具，很多人都應該不以為然。畢竟雖然冷凍電鏡和X射線晶體學、核磁共振被稱作結構生物學研究的三大利器，但不得不承認冷凍電鏡是三者當中最弱的一種技術手段，在現在已解析的一千多種膜蛋白結構當中，90%以上都採用的是X射線晶體學方法，而核磁共振在小分子量的蛋白結構解析中也發揮了重要的作用。

　　然而2013年12月5日，美國加州大學舊金山分校副教授程亦凡與同事David Julius兩個實驗室合作，採用單電子計數探測器，以近原子解析度(3.4 埃)，確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白TRPV1的結構，這一振奮人心的成果讓研究人員們開始重新審視冷凍電鏡在結構生物學研究中的所能發揮的作用。畢竟和X射線晶體學方法相比，它所需的樣品量很少，也無需生成晶體，這對於一些難結晶的蛋白質的研究帶來了新的希望。

　　日前，在「2014冷凍電鏡三維分子成像國際研討會」召開期間，儀器信息網編輯特別採訪了前來參加會議的程亦凡，請他介紹了研究所用的新型探測器件對提升冷凍電鏡解析度的影響，冷凍電鏡技術的發展是否意味著X射線晶體學時代的結束?冷凍電鏡未來的發展方向及需要關注的問題?

美國加州大學舊金山分校副教授程亦凡

　　採用直接電子探測技術使冷凍電鏡的解析度達到近原子解析度水平

　　儘管人們早已認識到，冷凍電鏡有潛力達到原子級別的解析度，但現在要實現這一點還面臨著許多的挑戰。在程亦凡的研究中，他的實驗室參與了對冷凍電鏡所用的相機進行的改進，和單電子計數探測器的研發。單電子計數探測器是一種直接電子探測器件，能夠直接檢測電子，而不需要像傳統CCD相機那樣先將電子轉換成光子，然後再轉化為光電子進行探測。

　　程亦凡介紹說：「傳統的CCD相機的DQE(檢測量子效率)在低頻僅為30%左右，高頻則更低，嚴重影響了高解析度信息的採集。因而研發新的探測器來提高解析度是冷凍電鏡研究的一個重要課題。這方面的研究主要是由我在UCSF的同事和合作者David Agard教授，以及英國MRC的Richard Henderson教授, 和UCSD的幾位教授推動的。他們在很多年前就都預見到相機開發對電鏡技術是一件很重要的事情。可以說David Agard非常有遠見，他預見到單電子計數的重要性，並決定要和Gatan一起做單電子計數探測器，而其他幾家公司覺得單電子計數很難有實際應用。」

　　「從2010年開始，三年多的時間裡，我們和Gatan公司及Lawrence Berkeley國家實驗室合作，在看不到前景的情況下，我們不斷的摸索。最終通過快速讀取與幾乎無噪音的電子計數組合，將相機的檢測量子效率提升到70%。通過實驗，我們也找到了單電子計數相機的最佳使用條件，並結合軟體算法的改進，使圖像模糊得以校正，實現了近原子解析度。」程亦凡說道。

　　目前，這種單電子計數相機已經由Gatan商業化，即K2 Summit Direct Detection Camera。其他兩家公司(FEI和Direct Electron)也推出了直接電子探測相機，但都不是單電子計數。據介紹，直接電子探測相機的價格都比較貴，對任何一個單位來說都是一筆很大的投資，如果要推廣，價格將是一個很關鍵的限制因素。「但是現在看來，有沒有直接電子探測相機幾乎決定一個電鏡實驗室有沒有機會在激烈的競爭之中站有一席之地。就像在一場球賽中決定你是在場上參加比賽的球員，還是在場外的觀眾。這對那些現在還沒有裝備這類相機的電鏡實驗室產生了很大的壓力。」程亦凡說。

　　冷凍電鏡的發展是否意味著X射線晶體學時代即將結束?

　　不用結晶直接解析蛋白質結構，並達到近原子解析度，這無異於是一場革命。那麼，冷凍電鏡技術的發展是否意味著X射線晶體學時代即將結束呢?在程亦凡看來，現在不會，將來也不會。

　　他說：「就目前來說，雖然冷凍電鏡的解析度有了很大的提升，比如我們可以看清小分子與蛋白質間的結合位點，但還無法看清楚小分子和蛋白質是如何結合在一起的。這一點，冷凍電鏡和X射線晶體學技術相比還是有差距的。現在冷凍電鏡技術的發展已經引起做基礎研究的人的興趣，但製藥公司還在觀望當中。如果冷凍電鏡的解析度能達到2埃左右，那對於藥物設計和篩選就非常有幫助，而且製藥公司在研發方面的投入遠遠大於基礎科研，如果他們認可這一技術，將帶來很大的市場。現在應用X射線晶體學技術的實驗室，將來都會用到電鏡技術。這樣的話，很多科研單位和製藥公司不會只配置一臺電鏡，而會是幾臺電鏡配套。同時他們對於冷凍電鏡人才的需求相應也會加大。和X射線晶體學相比，冷凍電鏡實驗室培養的學生還太少，遠不能滿足需求。」

　　「而未來，一個實驗室只掌握單獨的一樣技術是不夠的，結構解析當中，我們可以用不同的方法來做，沒有固定的模式，就看哪條路走的快了。此外將來的結構生物學研究，不再僅是解析結構，而是更加注重解決實際的生物學問題。生物學問題的系統性和複雜性需要我們從各個方面，結合各種技術來解決，單一的技術肯定是不夠的。所以，隨著冷凍電鏡技術的發展成熟，它會和X射線晶體學成為結構生物學研究中相輔相成的技術手段，而不是將其取代。」程亦凡說道。

　　冷凍電鏡的發展還需要解決和關注哪些問題?

　　對於冷凍電鏡發展需要解決的問題，程亦凡表示主要是進一步提高解析度，以及形成流程化的操作。

　　程亦凡說：「雖然和過去相比，冷凍電鏡的解析度有了很大提升，但目前還是徘徊在3埃左右，仿佛有一堵看不見的牆，如果能進一步突破達到2埃左右，將是一件非常有挑戰和令人激動的事情。但我們現在還不知道具體是什麼原因限制了解析度的提升，儀器、相機、樣品製備、軟體等的改進都可能帶來新的突破。」

　　對於要形成流程化操作，程亦凡這樣說道：「目前電鏡還沒有像X射線晶體學那樣形成流程化的操作，一個實驗室想在1-2年內熟練掌握這一技術很難。我們希望在今後3-5年內，能將冷凍電鏡形成流程化的技術，降低進入這一領域的技術門檻，讓更多的人能接受和了解，這樣冷凍電鏡技術才能真正推廣開來。」

　　採訪中，程亦凡特別對冷凍電鏡研究圈子的文化氛圍提出了自己的擔憂和看法。他說：「技術的發展對於文化的衝擊是很大的，有時我們可能沒有意識到它。目前，X射線晶體學和冷凍電鏡這兩個領域的文化就非常不同。X射線晶體學技術比較成熟，因而每個樣品的研究周期比較短，競爭也非常激烈，大家相互間的交流就很少，各自的研究內容在發表前也都是保密的。而冷凍電鏡領域，在過去十幾年間，我們彼此都大概知道每個實驗室在研究什麼，然後儘量避免研究同樣的東西。這樣做一是由於領域小，大家相互間都比較友好;另外更主要的是冷凍電鏡的研究周期比較長，如果有人已經開始做，後來的人想超過很難。」

　　「但現在隨著冷凍電鏡技術的發展，整個研究周期已逐漸變得越來越短，如果一個人在做，另一個人看到後做些改進很有可能就先出成果，這也導致電鏡領域的人越來越謹慎保密了。保密在某些方面是必須的，但也會成為阻礙技術發展的障礙。面對這種現實的趨勢，我們如何在適應的同時又不失我們固有的優秀文化傳統，這確實是一個挑戰。」

　　最後，當問及接下來關注的研究課題時，程亦凡表示：「我自己的興趣點還是膜蛋白或者說離子通道的研究。另外，我也希望做一些有挑戰性的，其他人可能覺得做不了的研究課題。」

　　此外程亦凡還特別提出對於冷凍電鏡電子衍射技術非常感興趣，並認為從事X射線晶體學研究的人一定要關注這一技術。他說：「在X射線晶體學研究中經常碰到的一個問題，就是晶體長不大，只能形成很小的晶體。目前解決這一問題的方法就是利用X射線自由電子雷射，當前世界上只有日本、美國和歐洲三個地方有這種類型的光源，而光源建造和使用的費用都非常昂貴。現在我們利用冷凍電鏡電子衍射法完全可以利用很小的晶體就進行結構解析，這是冷凍電鏡技術的一個全新的應用領域，非常值得關注。」

採訪合影

　　採訪編輯：秦麗娟

　　附錄1：程亦凡個人簡歷

　　http://cryoem.ucsf.edu/yifan_cheng/yifan.html

　　附錄2：冷凍電鏡:正在並將為中國提供廣闊的研究「舞臺」

　　http://www.instrument.com.cn/news/20140730/137799.shtml

　　附錄3：第七屆郭可信電子顯微學和晶體學暑期學校舉辦

　　http://www.instrument.com.cn/news/20140728/137553.shtml