這些特殊的日子裡，全民在抗擊疫情，科研人員則各展所長揭秘SARS-CoV-2，以期為COVID-19疫苗及藥物的研發、治療提供最有力的後盾。單細胞測序技術已經應用到生命科學研究的各個領域，在這一場正進行的攻克SARS-CoV2-2病毒的戰役中，它也沒有缺席。事實上，目前已發表的使用新冠病毒作為樣本的單細胞測序的文章並不多，但確為COVID-19研究中的點金之筆，基於scRNA-seq VDJ的免疫組庫測序更是在疾病發病機制、抗體開發、用藥及疫苗評估等多個方面提供了重要的信息。
自2017年發展起來的CITE-seq是一種新興的技術，其是基於在抗體上耦聯Oligo（寡核苷酸）並通過二代測序獲得Oligo信息從而識別抗體信息，結合scRNA-seq即可同時進行單細胞轉錄組和蛋白質組高通量分析或者進行scRNA-seq多樣本標記[1]。衍生的相應產品被稱為TotalSeqTM antibody conjugate。現可應用於10X Genomics單細胞測序平臺的TotalSeqTM 抗體分為A、B和C三個系列，分別應用於10X Genomics 不同的scRNA-seq試劑盒。TotalSeqTM 結合 scRNA-seq可應用於癌症、基礎免疫、新標誌物發掘、新細胞及罕見細胞的鑑定、神經免疫學、疫苗研發等各方面。
圖a TotalSeqTM conjugate 示意圖
圖b TotalSeqTM 不同系列抗體對應的10XGenomic試劑盒
視頻：TotalSeqTM W使用Workflow
圖片、視頻信息來源：https://www.biolegend.com/
在特效藥缺乏的情勢下，目前針對COVID-19治療的方向主要有三個，一是針對現有藥物的有效性的研究，這是目前新冠相關臨床試驗的主流；二是篩選有效中和抗體，以製備抗體藥物；三是COVID-19疫苗研發。對於當下的COVID-19的助力，TotalSeqTM 和 scRNA-seq 的「珠聯璧合」具體體現在哪些方面呢？
TotalTM -seq用於抗原表位及中和抗體篩查
Flex-TTM MHC Tetramer四聚體技術在疫苗研發及使用監控中發揮重要作用，若結合使用TotalSeqTM 則可通過高通量手段更高效地鑑定和篩選T細胞特異性抗原表位，尤其是針對疫苗研發前期疫苗抗原表位設計過程中。除作為檢測和篩選抗原特異性T細胞的有效手段外，Flex-TTM MHC Tetramer還可用於分析T細胞對病毒等各類病原體的反應情況。Flex-TTM MHC Tetramer是利用T細胞表面的TCR受體能與特異性小肽結合的特性進行人工構建的MHC-多肽複合物，單個MHC-肽複合物對TCR分子的親和力較弱，而多個MHC-肽複合物通過與Streptavidin聚合形成的Flex-TTM MHC Tetramer多聚體的親和力顯著提高，且因複合物上還有螢光素等標記物，還可使用流式細胞儀等檢出針對特異表位肽段的T細胞。
註：BioLegend Flex-TTM 流程。MHC單體上預載的可交換敏感肽在紫外光的照射下降解，目標肽段結合至MHC單體上，MHC單體-肽與Streptavidin結合形成Flex-TTM 四聚體複合物，四聚體複合物與抗原肽特異性T細胞結合。
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通常情況下，用於與MHC-肽複合物聚合的Streptavidin在流式實驗中的標記物為螢光基團，在單細胞測序中如需要實行相似的應用則可將多個MHC-肽複合物與標記有特定Oligo的Streptavidin（即Streptavidin-Oligo）或者同時標記Oligo和螢光基團的Streptavidin(即Streptavidin-PE-Oligo）形成MHC-Tetramer，Streptavidin-Oligo或者Streptavidin-PE-Oligo與肽-MHC單體聚合形成MHC-Tetramer接著用於樣本細胞標記，最後通過測序平臺獲得的Oligo信息識別抗原特異性T細胞相應的抗原肽表位。
註：圖a,Steptavidin-PE-Oligo示意圖；圖b CITE-seq & Flex-TTM Workflow；圖c: 針對CMV dornor來源樣本分析抗原特異性T細胞；上圖使用流式抗體和PE-Tetramer標記，並用使用流式技術分析；下圖使用TotalSeqTM 和Streptavidin-Oligo聚合的MHC-tetramer並用CITE-Seq技術進行分析。兩種技術得出了相似的結果.
信息來源：圖片來源於https://www.biolegend.com/；數據來源於BioLegend廠家內部測試.
與常規的四聚體篩查特異性抗原表位相比較，使用TotalSeqTM 標記四聚體是通過Streptavidin 上Oligo的序列識別多肽信息，故無需考慮螢光素種類的限制以及在使用流式細胞儀的補償問題等，因此可極大地提高抗原表位篩選通量；其次，樣本中的抗原特異性T細胞較少，使用Steptavidin-PE-Oligo結合的MHC-Tetramer標記的細胞可先經流式細胞儀進行富集後再進行後續的高通量分析；此外，對同一份樣本中可同時分析多種對抗原特異性T細胞的的信息。最後，若同時加入其它的TotalSeqTM 抗體並結合scRNA-seq，則可同時對多種特異性T細胞的表面蛋白信息及轉錄信息進行分析。
TotaSeqTM & scRNA-seq用於中和抗體篩查
北京大學BIOPIC/ICG謝曉亮教授及其合作者基於VDJ scRNA-seq 分析了來源於COVID-19恢復者的記憶B細胞BCR序列庫，並成功篩選出了14種SARS-CoV-2的有效中和抗體[2]。2019年12月，Ian Setliff等人開發了LIBRA-seq （linking B cell receptor to antigen specificity through sequencing）技術。LIBRA-seq技術原理與CITE-seq一致，研究人員在每種抗原上連結特定的DNA標籤，特定的BCR與抗原的結合信息可通過測序獲得，因抗原與特定BCR結合建立了一一對應關係，最後通過高通量單細胞測序，就可以知道每個B細胞中BCR的序列和這個BCR識別的抗原種類。由於BCR的可變區序列與抗體的可變區序列相同，因此獲得相應的BCR序列即可體外大規模製備抗體，相對於VDJ scRNA-seq 篩選中和抗體而言，LIBRA-seq篩查的方法更加直接有效[3]。
註：圖a, LIBRA-seq schematic 圖b, Antigen-biotin示意圖
如上，小編介紹過TotalSeq™（PE）Streptavidin用於TCR相應的特異性多肽篩選。理論上而言，若Antigen上偶連了biotin，那麼也可通過SAV與TotalSeq™PE Streptavidin結合，形成Antigen-biotin-Streptavidin-(PE)-Oligo複合物， Antigen的信息即可經標記於Streptavidin上的Oligo通過高通量測序進行識別；此外，若Streptavidin上同時標記了PE，則可先將抗原特異性B細胞富集再行免疫組庫及抗原信息分析。因此，相對於LIBRA-seq直接標記抗原，這種標記Antigen用於抗體篩選的方式更加靈活便捷且可形成多聚體增加結合效率，不失為使用特異性抗原標記進行抗體大規模篩選的策略之一。
TotaSeqTM & scRNA-seq對 COVID-19免疫響應評估
TotalSeqTM 可用於檢測感染類疾病過程中的免疫動態變化，也可以針對某種疾病用藥後的外周血樣本進行評估，確認藥物及疫苗是否激發免疫反應及其功效，這也是TotalTM -seq最基本的應用。個體差異會導致不同個體對疫苗及藥物的免疫反應不一樣，因此使用高通量地測序方案評估免疫反應是當下的最佳選擇。在已發表的針對COVID-19病人樣本中的單細胞測序研究中，就有多篇文章是對COVID-19病人樣本肺泡灌洗液、外周血中的免疫細胞圖譜、免疫細胞比例變化、TCR/BCR變化進行分析[4-6]。當然，單純的scRNA-seq分析之後大部分研究人員需要接著使用流式細胞術或者質譜流式進行表面抗原分析。自CITE-seq的出現讓轉錄組分析及表面抗原分析同時分析成為可能。Yuri Kotliarov等人就曾猜測雖然個體的免疫具有差異性，Yuri Kotliarov等人就曾猜測雖然個體的免疫具有差異性，但是這可能歸因於baselineimmune variations，為了找到這些具有預測性的因素，作者使用CITE-seq技術針對接種流感疫苗及黃熱病疫苗的人群進行免疫評估，並發現了能夠提高疫苗免疫效應應答的調節通路。在此研究中，研究人員使用的表面CITE-Seq表面marker共有82個，極大地豐富了研究信息[7]。相對於單純得使用scRNA-seq進行免疫評估而言，同時使用total-seq抗體有諸多優勢，如降低信號的Dropout問題節約實驗成本、節約成本、細胞分群更加清晰明確、同份樣本獲得雙份信息避免操作差異等。而BioLegend目前已推出的TotalSeqTM 抗體超過1000多種，並且在不斷地更新中，這對於有不同需求的科研人員而言無言是極好的訊息；而能夠用應用於human不同10X Genomics試劑盒（V2，V3,，VDJ）的針對TBNK細胞的TotalTM -seq 抗體panel也已上市，這使得需要針對不同個體同時進行免疫相關轉錄組及蛋白組信息監控也更為簡單高效。註：TotalSeq™-A、TotalSeq™-B和TotalSeq™-C TBNK Cocktail用於鑑定的PBMC中的主要免疫細胞亞群
單細胞測序技術高通量以及專一的特點有利於我們獲得更多的信息。但是，針對新冠病毒樣本的研究，選樣對於最終的結果影響非常大。根據CDC的統計結果，患有基礎病比如糖尿病、慢性肺病及心臟病等伴隨疾病的人會更大可能導致新冠併發症，加上年齡以及用藥等因素都會造成很大的免疫差異，因此除控制篩選條件外，需加大樣本量進行單細胞測序的最終分析；在單細胞測序過程中，當樣本量增多時，可採用多樣本標記方案同時建庫增加樣本例數並減少技術誤差。其技術原理基於相同的抗體被標記上含有不同Barcode的Oligo之後分別被用於標記不同來源樣本，標記後的樣本經一定比例混合後作為同一個樣本進行上機建庫，最後通過耦聯的Oligo識別序列區分樣本來源。用於多樣本標記的TotalTM -seq抗體也稱為Hash-tag抗體，現有的Hash-tag抗體有基於兩種方案，一種是基於與表面抗原結合的標籤抗體，這種方案主要用於新鮮樣本進行多樣本標記；另一種則是基於與核蛋白複合物結合的標籤抗體，可用於凍存凍存樣本；後話：如上，希望TotalSeqTM 的珠聯璧合可以為COVID-19的研究和治療提供切實的助力。最後，我們再來看看單細胞測序技術在COVID-19研究中的「高光時刻」。
1.單細胞測序技術與COVID-19免疫機制研究
Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19
Blood single cell immune profiling reveals the interferon-MAPK pathway mediated adaptive immune response for COVID-19
A single-cell atlas of the peripheral immune response to severe COVID-19
第一篇是發表的使用單細胞用於與新冠樣本相關最早的文章，用於探討感染者體內的免疫水平變化，作者利用單細胞測序對患者肺泡灌洗液（Balf）進行轉錄組分析及BCR/TCR分析，比較分析了重症患者和輕症患者的肺部免疫微環境，描述了感染者體內免疫細胞分群的變化、免疫細胞的異質性程度、TCR/BCR免疫組庫的改變等；第二篇文章主要解析了不同時期COVID-19病人樣本中PBMC各免疫細胞比例及TCR/BCR的變化；2020年4月17日，來自史丹福大學的Catherine團隊的研究揭示了新冠患者PBMC中的表型重構，並提供了針對重症COVID-19免疫反應的細胞圖譜。
2.單細胞測序技術與中和抗體藥物研發
來自北京大學BIOPIC/ICG謝曉亮教授及其合作者的研究則使用VDJ單細胞測序技術針對記憶性成功地從60多名新冠患者恢復期血漿中篩出14種針對新型冠狀病毒SARS-CoV-2-的高強效中和抗體，其中，BD-368-2對SARS-CoV-2的IC50值為100pm。接著研究人員證實了BD-368-2對hACE2感染小鼠治療效果以及hACE2健康小鼠的預防感染效果，而結構生物學結果也顯示BD-368 &Spike2&ACE2三聚體中， BD-368表位與ACE2重合。
SARS‐CoV‐2 receptor ACE2 and TMPRSS2 are primarily expressed in bronchial transient secretory cells
SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is enriched in specific cell subsets across tissues
SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor.
如果可以掌握了哪些細胞易受到攻擊，那麼就可以開發有針對性的治療方法，從而避免或者阻斷機體受新冠病毒的感染。研究人員曾針對健康人群樣本中人類呼吸道（包括鼻腔通道，下呼吸道和肺）中的細胞及新冠感染者鼻腔、肺、支氣管及腸道等組織來源的樣本進行單細胞測序，通過這種高通量的篩選，從中發現了 ACE2 和TMPRSS2共表達的主要的三類細胞——杯狀分泌細胞（goblet secretory cells）、Ⅱ型肺泡細胞（type II pneumocytes）和消化道吸收性腸上皮細胞。
Simultaneous Epitope and Transcriptome Measurement in Single Cells.
Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients' B cells
High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity
A single-cell atlas of the peripheral immune response to severe COVID-19
Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19
Blood single cell immune profiling reveals the interferon-MAPK pathway mediated adaptive immune response for COVID-19
Broad immune activation underlies shared set point signatures for vaccine responsiveness in healthy individuals and disease activity in patients with lupus
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