何愛彬研究組開發高通量單細胞ChIP-seq技術——CoBATCH並解析多...

2019年8月27日，北京大學分子醫學研究所，北京大學-清華大學生命科學聯合中心研究員何愛彬研究組在Molecular Cell雜誌在線發表題為「CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling」的文章，報導了一種新的具有普適性、易操作、高通量和高質量的單細胞ChIP-seq技術，並將其命名為CoBATCH（combinatorial barcoding and targeted chromatin release）。這一單細胞技術不僅適用於研究各種組蛋白修飾，同時也能捕獲DNA結合蛋白在基因組上的結合信息。利用這一單細胞技術，研究者首次解析了小鼠胚胎10個器官（心臟、肝臟、肺、左腦、右腦、後腦、腎臟、皮膚、肌肉和小腸）的內皮細胞譜系發育、分化和功能的異質性。

基因的表達是生物體一切生命活動的基礎，DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體重新定位等表觀遺傳的調節對基因表達調控具有重要作用。這些表觀遺傳修飾的變化往往會導致基因表達的改變，從而進一步對基因組穩態的維持，發育的時空調節，細胞的命運決定等重要的生命過程產生影響。蛋白質和DNA相互作用的染色質免疫共沉澱技術（ChIP-seq）技術是研究表觀遺傳調控的一種重要手段，這項技術可在全基因組範圍內識別順式調控元件和反式作用因子的互作信息，並能構建基因表達調控網絡，從而加深我們對生命過程調控機制的理解。

單細胞測序技術目前被廣泛用於研究發育與疾病相關細胞群體異質性和繪製細胞圖譜。隨著技術的發展，這項技術正逐漸將生命科學研究推進到新的維度。在單細胞表觀組領域，雖然DNA甲基化測序、染色質構象捕獲技術、染色質開放程度測序已經分別在2013年（scRRBS [1]）、2013年（single cell Hi-C [2]）、2015年（scATAC-seq [3]）實現了單細胞水平測序。研究基因表達調控與細胞命運決定的機制，最直接的證據是特定染色質區域與蛋白的相互作用，然而，高效的單細胞染色質免疫共沉澱測序（scChIP-seq）技術尚未出現。

常規ChIP-seq技術需要使用超聲打斷交聯的基因組片段，然後用特異性抗體富集含有目的蛋白結合的基因組片段，並將目的DNA片段純化後，添加接頭進行建庫測序。這一系列操作使得ChIP-seq需要百萬個細胞作為起始材料。為降低ChIP-seq技術對細胞數目的要求，近年來，MOWChIP [4]，STAR-ChIP [5]和ULI-NChIP [6]等適用於少量細胞起始的ChIP-seq技術被逐漸開發出來，但細胞群體的異質性，發育過程中染色質狀態的動態變化需要在單細胞解析度進行進一步的研究。雖然Drop-ChIP [7]第一次實現了單細胞水平ChIP-seq，然而這一技術依賴特殊的微流控裝置，並且每個細胞只能捕獲到約800個DNA片段，這極大地限制了這項技術的推廣應用。隨後開發的scChIC-seq [8]雖然實現了單細胞水平的解析，但是獲得的單細胞數據的基因組比對率只有約6.1 %，大大增加了測序成本，且通量較低。另外，單細胞CUT&Tag [9]需要依賴Takara ICELL8這一特殊裝置。綜上，目前還缺乏一種具有普適性、易操作、高質量的單細胞ChIP-seq技術。為此，何愛彬課題組開發出一種新型單細胞ChIP技術CoBATCH，巧妙地將染色質片段化和PCR接頭添加融合在一步完成，顯著地提高了ChIP的效率，同時用組合標籤的方法實現了對單細胞進行高通量地標記，是目前世界上最先進、最高效的ChIP-seq技術，並用這項技術首次解析了多器官內皮細胞譜系發育的表觀與功能異質性。這項研究將單細胞表觀組學新技術的研究、普及和應用往前推進了一大步。

研究人員首先開發了一種新的適用於少量起始細胞的技術，並命名為in situ ChIP（即不需要消化分離細胞組織）。在這一技術中，作者將Protein A蛋白與轉座酶Tn5的N端進行融合得到融合蛋白Protein A-Tn5 (PAT)。將目的細胞與特定抗體孵育之後，向細胞中加入PAT融合蛋白並與特定的抗體結合。之後，激活PAT的反應活性，被抗體識別的特定基因組區域能被PAT切割，並帶上接頭序列。終止反應後，帶上接頭的目的DNA片段能直接用於PCR和建庫（圖1）。

圖1. 原位細胞與組織in situ ChIP技術原理圖

重要的是，in situ ChIP技術可直接用於不經過消化的胚胎樣品和組織切片。研究人員對小鼠E6.5, E7.0和E7.5未經消化的整個胚胎進行H3K27ac和H3K4me3 in situ ChIP-seq，發現這些組蛋白修飾在胚胎發育相關的特定基因組區域有明顯的富集，GO分析表明，這些特異富集的信號與胚層發育過程密切相關。另外，研究人員證明in situ ChIP同樣適用於捕獲少量細胞轉錄因子在基因組的結合信息。因此，in situ ChIP對樣品本身沒有限制，原管操作簡單方便，實驗能在一天內完成，大大提高了ChIP的效率，有極強的應用價值和普適性。

進一步地，研究者對in situ ChIP進行拓展，創造性地將PAT處理基因組DNA與組合標籤標記單細胞兩種方法結合起來，首次開發出具有高通量特性和普適性的單細胞ChIP-seq方法，命名為CoBATCH（圖2）。其原理是將孵育完抗體的細胞分到不同的孔，用帶有不同barcode的PAT進行切割後使細胞帶上第一輪標籤，然後將所有細胞合併，重新分配到不同的孔，最後用不同的PCR引物進行擴增使細胞帶上第二輪標籤。利用這一方法，研究人員能在每一個單細胞中捕獲平均12,000個非重複DNA片段，且一次實驗通量可達10,000單細胞。與其他單細胞ChIP-seq技術相比，CoBATCH具有更高的準確性、信噪比、基因組比對率，並能捕獲更多的單細胞DNA片段。

圖2. 高通量單細胞ChIP-seq CoBATCH 技術流程圖

內皮細胞組成了哺乳動物體內的脈管系統，和血液循環、造血、免疫、壓力感應以及器官形態建成等生命活動密切相關。研究者應用CoBATCH技術解析了小鼠胚胎期16.5天，來自10個器官的Cdh5+ 譜系的內皮細胞的H3K27ac水平的異質性，通過系統的生物信息學分析，作者精確地識別了不同的細胞亞群，它們分別與動靜脈的發育，內皮-間質轉化（EndoMT）等過程相關，並且，不同器官來源的細胞可能保留著胚層發育的表觀信息。有趣的是，作者還鑑定了一群與免疫相關的細胞，它們可能參與了免疫系統的發育和調控。同時，心臟內皮譜系的細胞也表現出很強的內部的異質性，作者用RNA Pol II和H3K36me3 CoBATCH單細胞數據識別出巨噬細胞樣細胞，間質細胞和內皮細胞等不同的細胞類型。這些研究結果證明了CoBATCH可以解析不同器官來源的內皮細胞表觀異質性以及順式作用元件在發育過程中的動態變化，為理解器官功能特異的內皮細胞發育提供了重要線索。

簡而言之，CoBATCH技術是第一個具有普適性、高質量、高通量的單細胞ChIP-seq方法，該技術將在單細胞水平上為解析細胞命運決定和功能異質性的表觀遺傳調控機制提供強有力的支持，並對研究器官發育和疾病發生過程具有重大的意義。北京大學分子醫學研究所博士生王千昊、艾珊珊、劉雅茜和北京大學生命科學聯合中心博士生熊海清、餘先紅為論文共同第一作者，何愛彬為本文的通訊作者。該研究獲得了科技部幹細胞專項、國家自然科學基金委的和生命科學聯合中心的支持。