吳昊團隊開發檢測單細胞mRNA動態變化新技術scNT-seq

責編 | 兮

細胞命運轉變以及響應外界信號的過程中會改變細胞類型特異（cell-type-specific）的基因表達，而基因表達的豐度(total RNA level)是由mRNA轉錄、加工、降解等過程共同決定的。在含有多種細胞類型的複雜組織和系統中，在單細胞水平準確測定這些 mRNA動態變化過程對於理解基因表達調控的重要性不言而喻。傳統的mRNA代謝標記技術利用尿苷類似物4-硫尿苷（4sU）可以有效的標記新生mRNA，但是技術上的局限性不能達到單細胞解析度；而常規單細胞轉錄組測序技術雖然可以揭示不同細胞類型的穩態轉錄組，但是不能精確分辨特定時間裡新生成的和已有的mRNA，因此用於定量研究細胞類型特異的mRNA動態調控機制十分困難。

為了應對這一挑戰，賓夕法尼亞大學吳昊實驗室開發了一種高通量檢測單細胞mRNA動態變化的新方法, scNT-seq（全稱single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。該方法創新性的整合了mRNA代謝標記 (metabolic labeling)，基於液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細胞轉錄組分析技術和最近開發的4sU化學轉化反應 （chemically recode 4sU to cytosine analog ）【1】；在數據分析方面，作者構建了基於unique molecular identifier(UMI) 的統計模型來更加準確地分析單細胞水平上新生成的mRNA的比例。2020年8月31日，Nature Methods雜誌在線發表了文章「Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq」。作者應用這一技術解析了小鼠神經元快速激活過程中的單細胞基因調控網絡並預測細胞狀態變化軌跡，他們還進一步研究了不同胚胎幹細胞狀態轉換過程中的mRNA動態變化的調控機制。

圖1 scNT-seq的流程圖

scNT-seq具體技術流程如下：首先將4sU添加到培養基中用來標記細胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細胞轉錄組中區分含有4sU標記的轉錄本，將4sU化學轉化反應整合到液滴微流控 (Drop-seq)【2】流程中（圖1第2-4步）。由於捕獲mRNA的barcoded beads具有區分不同轉錄本的UMI序列，相比較沒有UMI的單細胞分析技術（e.g. scSLAM-seq）【3】，該方法不僅可以消除由於PCR擴增帶來的誤差，而且相對於單個mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。最後，利用基於UMI的二項式混合分布來準確估計每個細胞中單個基因的新生轉錄本。（圖1第9步）

圖2 利用scNT-seq技術研究小鼠大腦皮層神經元中神經活性調控的轉錄動態

前人的研究表明，神經元激活後可以快速誘導（幾分鐘到幾小時內）幾百個特異基因表達，這些基因被稱為神經活性調節的基因（Activity-regulated genes, ARGs）。利用ARGs被神經活性快速誘導而在靜息狀態下幾乎不表達的特點，可用其評估scNT-seq技術檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標記原代培養的小鼠大腦皮層神經細胞，其間用氯化鉀（KCl）激活這些細胞（15-120分鐘）（圖2a）。作者首先將大腦皮層神經元聚類成不同細胞類型，包括興奮性神經元（Ex）、抑制性神經元 (Inh)、神經元前體細胞（NP）等（圖2b）。接下來他們分析了不同細胞類型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產生於4sU標記的2小時內）和舊（old RNAs，產生於2小時前）轉錄本在不同細胞類型中的表達水平。這些ARGs的new RNAs在不同細胞類型中有不同程度的響應，而old RNAs沒有明顯響應（合成於4sU標記和神經元激活前），說明scNT-seq可以準確區分新舊轉錄本。

在準確區分新、舊轉錄本的基礎上，作者運用新近開發的Dynamo算法程序在興奮性神經元中進行了基於mRNA代謝標記的RNA velocity分析（圖2d右側），能準確捕獲神經元激活早期（0 – 15min）和晚期（30 – 120 min）的變化。相較之下，傳統的RNA velocity利用已拼接（無內含子）和未拼接（有內含子）的轉錄本信息來間接地預測細胞中基因表達的變化趨勢。由於Jun, Fos等早期響應基因內含子長度較短，基於內含子/外顯子定量的傳統RNA velocity方法無法準確估計這些基因的動態變化，因此無法鑑定到神經元激活早期（0 – 15min）的變化 (圖2d左側）。而基於新生成轉錄本的RNA velocity能夠直接利用實驗準確定量的新、舊轉錄本的信息，推測mRNA的動態變化，不受基因結構（內含子比例）影響，兼具準確性和適用性。

圖3 利用scNT-seq技術研究小鼠胚胎幹細胞不同細胞狀態的mRNA豐度調節策略

細胞中RNA的豐度由轉錄、加工、降解等過程共同決定，準確測定細胞群體中稀有或動態變化的細胞類型中mRNA合成和降解速率是一個重要而充滿挑戰的問題。前人的研究表明，小鼠胚胎幹細胞存在不同的幹細胞狀態，其中大約1%的細胞會自發轉變為具有更高分化潛力（totipotent）的「2C-like」狀態（2-cell embryos like state）。作者通過pulse-chase的標記策略結合scNT-seq技術測定了2616個基因在不同細胞狀態中的降解速率（half-life，圖3a,b）。結合4小時4sU標記實驗，作者測定了445個差異表達基因的合成和降解速率。根據mRNA合成速率和降解速率在不同細胞狀態間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調節策略（圖3c）。有意思的是，即使採用同一種調控策略的基因，mRNA合成和降解對於不同基因mRNA豐度調節的貢獻也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都採用「Destabilizing」策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度（圖3c）。

總的來說，scNT-seq是一種能在單細胞水平準確定量新生轉錄本的新技術。和已有的單細胞代謝標記分析方法【3】相比，這項新技術兼具高準確度，高通量和低成本等優勢。因此，scNT-seq與Jay Shendure實驗室的曹俊越博士新近開發的sci-fate技術【4】，都能夠廣泛應用於分析大量單細胞在細胞命運決定和分化，外界信號響應，及疾病模型等動態過程中mRNA表達調控等相關的重要生物學問題。

據悉，賓夕法尼亞大學吳昊教授為通訊作者，邱琦博士和胡鵬博士為共同第一作者。邱琦博士建立了scNT-seq文庫構建方法，胡鵬博士開發了scNT-seq數據分析流程，邱肖傑博士 (Whitehead Institute, https://github.com/aristoteleo) 在基於Dynamo的RNA velocity分析上提供了幫助。

---

吳昊博士簡介（附招聘廣告）

吳昊博士本科畢業於清華大學生命科學學院，2002-2009年於加州大學洛杉磯分校（UCLA）獲得博士學位。2010-2015 年於Harvard University/Boston Children’s Hospital (遺傳學系，幹細胞和再生醫學系)從事博士後研究。吳昊博士長期致力於DNA修飾相關的表觀遺傳學和單細胞組學技術的研發及其在幹細胞，神經發育和相關疾病中的應用（PNAS 2007; Science 2010; Nature 2011; Genes & Development 2011; Cell 2013; Nature Biotechnology 2014）。他曾獲得NIH Pathway-to-Independence Award（2014）和 NIH Director’s New Innovator Award （2017）。自2016年建立實驗室以來，以通訊作者在Nature Biotechnology (2018)、Nature Methods (2020)、Molecular Cell (2017)、Genes & Development (2018) 和Protein & Cell (2020) 等主流雜誌發表多篇工作。歡迎通過實驗室網站了解更多信息（https://www.wulabupenn.org/）。

吳昊實驗室正在招募博士後，歡迎對生物信息學、基因組學、表觀遺傳學感興趣的同學申請（請發送CV、感興趣的研究方向以及三個推薦人的聯繫方式發送至

[e-mail]）。

原文連結

https://www.nature.com/articles/s41592-020-0935-4

製版人：琪醬

參考文獻

1. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C. & Simon,M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing throughnucleoside recoding. Nat. Methods 15, 221–225 (2018).

2. Macosko, E. Z. et al. Highly parallel genome-wide expression profilingof individual cells using nanoliter droplets. Cell 161, 1202–1214 (2015).

3. Erhard, F. et al. scSLAM-seq reveals core features of transcriptiondynamics in single cells. Nature 571, 419–423 (2019).

4. Cao, J., Zhou, W., Steemers, F., Trapnell, C. & Shendure, J.Sci-fate characterizes the dynamics of gene expression in single cells. Nat.Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0480-9 (2020).