泛癌單細胞RNA-seq識別22種癌症類型細胞異質性重複程序

腫瘤細胞可塑性和異質性在疾病進展及治療中起著關鍵作用。例如，罕見的腫瘤細胞亞群可能是造成癌細胞耐藥性及轉移的潛在因素。目前，實驗室培養的細胞系是癌症研究的主力軍，但不清楚它們在多大程度上概括了腫瘤惡性細胞之間的異質性。隨著測序技術的發展，單細胞RNA測序（scRNA-seq）已經成為研究腫瘤內異質性（ITH）的有效工具。

近日，來自以色列魏茨曼科學研究所的Itay Tirosh團隊利用多重單細胞RNA-seq，分析了來自22種癌症類型的198個癌細胞系，確定了12個在多個癌細胞系中導致重複異質性的表達程序。此外，研究團隊還建立了特定的腫瘤細胞異質性模型，可用於研究衰老相關細胞的亞群，以證明其動態性、調節性和獨特的藥物敏感性。該研究成果發表在Nature Genetics上，文章題為「Pan-cancer single-cell RNA-seq identifies recurring programs of cellular heterogeneity」。

文章發表在Nature Genetics上

研究團隊開發了一種多路復用方法，利用10x Genomics Chromium系統對不同細胞系進行單細胞RNA-seq分析，基於基因表達和SNPs的細胞系分配對於98%的細胞是一致的（圖1）。在去除低質量數據後，研究人員檢測分析了來自198個細胞系的53513個細胞的表達譜，平均每個細胞檢測19264個單分子標籤（UMIs）和3802個基因，可反映22種癌症類型（圖1）。

圖1.多重scRNA-seq鑑定細胞系內表達的異質性及研究的癌症類型分布。來源：Nature Genetics

在單個細胞系的細胞間（包括離散的細胞亞群），研究團隊發現了基因表達的廣泛可變性，並利用t-SNE在11%的細胞系中發現了離散簇，表明離散亞群通常是細胞系特有的。通過識別每個細胞系中細胞狀態的連續和離散可變性，在所有細胞系中檢測到1445個表達程序，在單個細胞系中存在4~9個這樣的程序。基於這些表達程序的共同基因，研究分析強調了相似程序的群集，稱之為基因表達的重複異質程序（RHP）。最終，研究人員確定了12個RHP，其中兩個最顯著的RHP可反映細胞周期。細胞周期RHP對應於G1/S和G2/M期，並且在臨床腫瘤樣本中也可以觀察到（圖2）。

圖2.體外及體內細胞周期的異質性模式。來源：Nature Genetics

結果顯示，另外10個RHP反映了不同的生物學過程，且在很大程度上獨立於細胞周期狀態或被非周期細胞優先表達。研究人員通過對這10個RHP的標誌基因、細胞系和潛在調節元件對這10個RHP進行了表徵（圖3）。

圖3.10個RHP的功能注釋。來源：Nature Genetics

研究發現了與多種類型應激反應有關的RHP。其中，RHP(8)反映了一種應激反應，包括DNA損傷誘導的和即刻早期基因（DDIT3、DDIT4和ATF3），類似於在黑色素瘤和HNSCC腫瘤中發現的程序；RHP(4)含有IFN響應基因（IFIT1-IFIT3），與卵巢癌中觀察到的異質性程序非常相似。IFN響應可能是由基因組不穩定性通過cGAS-STING通路觸發的；RHPs(9，10)分別由與蛋白質摺疊和成熟以及蛋白酶體降解相關的基因組成。這也是唯一不同於任何體內異質性程序的RHP。

分析發現，與上皮-間充質轉化(EMT)相關的RHP RHP(2)，即EMT-I，是黑色素瘤特異性的，並與另一個黑色素瘤特異性RHP(1)呈負相關。後者與皮膚色素沉著基因（MITF和PMEL）相關，在黑素瘤腫瘤中可觀察到這兩種黑色素瘤特異性RHPs及其負相關模式。RHP(3)，即EMT-II，包括vim，FN1等基因，主要可在HNSCC細胞系中觀察到；RHP(5)，EMT-III在非周期細胞中包含了參與細胞連接組織的基因，如層粘連蛋白編碼基因。EMT-I和EMT- II在特定的癌症類型中表達豐富，突出了EMT是一種常見的，因環境而異的細胞異質性模式，可能對轉移和藥物反應有重要的意義。

此外，與衰老程序相關的RHP(6，7)可優先在G0細胞中被觀察到，反映了與細胞衰老有關的不同表達程序。RHPs 6程序包括衰老調節因子p21和其他p53靶基因；而RHP 7與低水平的增殖和分泌表型有關，與角質形成細胞、肺支氣管細胞和其他上皮細胞的衰老反應非常相似，該程序缺乏經典的衰老標記物(p16和p21)，被稱為上皮衰老相關（EpiSen）程序。

EpiSen程序是在衰老細胞中誘導的，但它的表達並不一定意味著完全的衰老表型。研究人員選擇具有EpiSen和EMT-II RHPs高度變異的HNSCC細胞株作為特定模型進行進一步分析，分離出EpiSen-high 和EpiSen-low兩個細胞亞群，其表達差異達12倍（圖4）。結果表明，EpiSen程序具有動態可塑性，且與遺傳亞克隆存在有限的關聯。隨後，研究人員比較了EpiSen-High和EpiSen-Low亞群對不同藥物的敏感性，結果表明EpiSen-High細胞對PI(3)K和AKT的抑制劑以及通過PI(3)K-AKT軸傳遞信號的EGFR和IGF1R的抑制劑更敏感；EpiSen-low細胞對細胞周期調節因子（CDKs、CHK1和拓撲異構酶）的抑制劑更敏感。此外，EpiSen可用於預測臨床藥物反應，為了研究EpiSen在西妥昔單抗臨床反應方面的潛在相關性，研究人員檢查了40例復發或轉移性HNSCC患者的大量預處理轉錄組數據，結果與體外觀察一致，EpiSen豐度在PFS較長的患者中顯著高於PFS較短的患者，其預測能力略高（圖5）。

圖4. EpiSen在三個亞群中的表達。來源：Nature Genetics

圖5.HNSCC細胞系（體外）和腫瘤（體內）基因表達熱圖和ROC曲線。來源：Nature Genetics

綜上所述，該研究利用單細胞RNA-seq技術描繪了198個細胞系的細胞多樣性圖譜，強調了在人類腫瘤中觀察到的異質性程序的特定模型，對這些模型系統的進一步研究可提供對ITH的理解，有助於利用ITH開發新的治療策略。

參考資料：

1. Kinker, G.S., Greenwald, A.C., Tal, R. et al. Pan-cancer single-cell RNA-seq identifies recurring programs of cellular heterogeneity. Nat Genet 52, 1208–1218 (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-00726-6