單細胞測序技術使我們能夠低成本、快速構建器官或者組織的大規模單細胞表達圖譜，了解器官或組織內細胞複雜的基因網絡以及單細胞中的調控機制，進一步探究各細胞群體的協同方式。2020年8月，來自康奈爾醫學院的Dan Landau博士（同時也在紐約基因組研究中心任職）等人在著名期刊Nature Reviews Genetics上發表了一篇題為「Integrating genetic and non-genetic determinants of cancer evolution by single-cell multi-omics」的綜述文章，為我們揭示了單細胞組學技術如何闡釋腫瘤進化的奧秘。今天，就讓我們通過本篇綜述，深入了解如何利用單細胞測序這一新技術從遺傳性和非遺傳性兩個角度審視腫瘤進化。
癌症自身進化過程本身就是一個惡性腫瘤細胞群體本身不斷「生長」不斷增加的一個過程，導致其基因組信息越來越多樣化，最終引起癌症不斷復發，並對各種藥物產生耐藥性。除了遺傳因素外，細胞間的變異還包括了細胞本身狀態、表觀遺傳學特徵、空間分布及與細胞生長的微環境互作等因素，這些都會加劇和推動癌症發生演化。因此，癌症的研究未來方向就是需要聚焦在單個細胞水平（體細胞進化最小單位）才能整合多個遺傳維度。這篇綜述中，作者討論了一些新興的單細胞測序技術，能夠為癌症進化提供一些新的線索。這些信息表明，癌症是體細胞在遺傳性因素和非遺傳性因素之間複雜相互作用所共同導致的結果。
癌症的進化史包括惡性轉化，然後發展為更具侵襲性和耐藥性的形式，最終在臨床上導致一些毀滅性的影響。體細胞突變，包括單核苷酸變異（SNV）和結構變異，對於癌症的發生和發展至關重要。但是近些年來，許多研究已經在健康組織中發現了大量的體細胞突變（somatic mutations），例如皮膚和食管暴露在環境致癌物後，組織中細胞發生突變，這表明癌症通常是由癌前克隆（pre-malignant clonal outgrowths）轉化成的。重要的是，克隆的體細胞突變沒有進展，甚至沒有退化，與癌症的復發驅動因素重疊。這些數據表明，僅遺傳機制可能不足以驅動腫瘤向著惡性程度發生轉化。
隨著惡性腫瘤細胞種群數量的增長，細胞基因組在遺傳水平會進一步多樣化，從而使腫瘤發生進展和轉移，並對藥物產生耐藥性。然而，大量研究證實並不是所有腫瘤進展、轉移及耐藥都與遺傳驅動因素有關，所以這表明癌症進展有大量的非遺傳因素參與。近幾年興起的多種單細胞測序技術如scRNA、scATAC、scMethy、scWGS、空間轉錄組等，分別揭示了細胞內腫瘤的異質性、表觀遺傳特徵、組織空間動力學以及與腫瘤微環境的相互作用。這些技術可能能夠為遺傳性和非遺傳性腫瘤內變異以及癌症的發展提供更多線索。因此，通過單細胞多組學技術能夠整合單個癌細胞的多層信息，是全面理解癌症進化機制的關鍵。
本文中，作者回顧了單細胞技術在實驗方面和生物信息方面最新的突破和進展，這些技術在單個腫瘤細胞中整合了可遺傳信息的多個維度。這篇綜述探討了癌症進化的遺傳和非遺傳途徑，這些途徑可以通過單細胞多組學研究得到全新的認識。由於最近對癌症異質性的遺傳來源和單細胞整合分析的技術方面的研究大量增加，因此作者在本文中呈現了大量令人信服的研究證據來表明，單細胞測序技術能夠整合單個癌細胞中多種信息，從而破譯腫瘤異質性與演化中的秘密。
遺傳異質性與譜系追蹤
Genetic heterogeneity and lineage tracing
2.1 Bulk測序對腫瘤克隆結構推斷（Inference of clonal architecture in bulk sequencing）通過持續積累（continuous acquisition）體細胞突變而產生的遺傳異質性是許多癌症克隆進化的基礎。這些遺傳異質細胞群體的克隆結構先前已經從大量的二代測序結果中得到證實。
全外顯子測序WES或全基因組重測序WGS數據中，整合體細胞突變的reads深度和變異等位基因頻率可用於推斷每個突變的腫瘤純度、倍性和局部拷貝數，從而確定癌細胞分數（Cancer Cell Fractions, CCF）。這些數據可以在一定程度上解決克隆和亞克隆的關係。在非整倍體實體瘤（aneuploid solid tumours）中，WGS可以通過確定SNV是否在大型擴增過程（例如全基因組複製WGD）之前或之後發生，來幫助對克隆體細胞的早期變化與晚期時間進行對比和時間上的推斷。當分析大型隊列時，發生驅動突變的進化序列的信息就能被揭示出來。因此，驅動事件可以分為早期和晚期。早期經常是祖先突變或叫祖系突變（ancestral mutations），例如骨髓瘤中的DNMT3A和TET2突變等。晚期的亞克隆驅動，如惡性腫瘤細胞中的SF3B1，TP53和NPM1突變，會導致持續選擇而產生的淋巴和髓樣惡性腫瘤的突變。
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CCF即cancer cell fraction，簡而言之，這個概念是指有多少細胞含有對應的變異。例如在某個腫瘤組織中所有腫瘤細胞都攜帶某個特定的體細胞突變，那麼這個突變的CCF即為1。CCF可以通過VAF、腫瘤純度和對應區間的拷貝數共同計算得到。基因組不穩定是腫瘤細胞的一個重要特徵，非整倍體擴增指的是染色體數目並不是成倍增加，而是部分染色體隨機丟失和獲得，導致非整倍體的腫瘤細胞產生。這種現象普遍存在於各種惡性腫瘤細胞之中，對腫瘤的侵襲能力、耐藥能力、轉移能力等都有不同程度的影響。驅動事件按照在腫瘤發生發展過程中的時間順序被（不嚴格地）分成了早期和晚期驅動事件。其中早期驅動事件通常可以在原發腫瘤中檢出，一般對於腫瘤的惡變和發展起到驅動作用；晚期驅動事件則可能發生在部分亞克隆當中，影響腫瘤的表型改變、耐藥和復發轉移等過程。
同樣，在腎細胞癌隊列研究中，可以將腫瘤分為進化亞型。例如PBRM1中具有驅動事件的腫瘤，隨後引起SETD2或PI3K中發生改變。這些可能與預後信息相關。因此，時序分析（timing analyses）已繪製出癌症中不同的進化軌跡或優先的突變序列，這表明腫瘤進化上優化的路徑和腫瘤基因突變之間的相互依賴性。
雖然亞克隆驅動因素的存在預示著癌症患者的臨床預後較差，但在診斷之前已積累多年的早期克隆驅動因素可能為早期幹預提供了機會。換句話說，在患者從病理上被診斷前，大量的早期突變和驅動事件已經發生，如果能「揪出」這些兇手，就為醫生及時幹預提供了機會。但是諸如WES和WGS等對整個組織進行Bulk測序，在低CCF條件下有諸多瓶頸，限制了其解決克隆系統發育關係的能力（limited in their abilities to resolve the phylogenetic relationships of clones）。
2.2 多重採樣追蹤定義克隆動態變化（Defining clonal dynamics through multi-sampling）癌症進化是一個動態過程，面對諸多挑戰，例如制定有效的用藥和治療方案等。適應性不同的克隆亞型，可能會重塑腫瘤的基因組信息。由於CCF隨時間變化的協調模式，在克隆進化過程中的不同時間點進行多次採樣甚至可以為CCF較低的亞克隆提供更高解析度的系統發生關係。有了更多的採樣時間點，可以在通過CCF識別出與其他亞克隆明顯不同的單個亞克隆，尤其是當它們具有明顯的生長動態時。此外，serial sequencing不僅可以提高克隆分解（clonal decomposition）的能力，還可以評估克隆特異性和適應性。
實際上，對CLL細胞或實體瘤患者血漿中的ctDNA進行時間點上的密集採樣，可以通過一些數學模型和生信算法來評估腫瘤中克隆生長進化動力學（clonal growth kinetics）與治療之間的關係。例如與治療前相比，化療後復發的CLL中TP53突變CCF比例有顯著提高。這表明面對治療這種壓力選擇時，包含TP53突變的亞克隆適應能力更強。相反，專門針對CLL的靶向治療方案會使得攜帶BTK突變的克隆增加，變得更加容易。在結直腸癌中，可以追蹤接受EGFR抑制劑治療患者血漿的ctDNA，來確定耐藥性克隆在治療前後發生的變化。值得注意的是，克隆生長的數學模型（mathematical modelling of clonal growth）能夠進行正推和反推，以預測未來的克隆比例並預估治療開始時耐藥細胞的數量。這些數據還為基於對不同克隆的治療特異性適應性效應的連續測量，為多種治療方案的組合而開發的算法，在算法優化上鋪平了道路。多重採樣的另一種形式是研究腫瘤內的多個區域，以評估腫瘤內克隆的空間組成。與多個時間點密集採樣比較相似的是，非小細胞肺癌NSCLC的多病灶部位採樣有助於研究人員更加了解這些克隆之間的關係，從而有助於改善臨床上進行分級和診斷。在進化選擇的一個顯著的例子中，醫生對多區域多病灶（如肝癌原發灶和轉移灶的多個結節進行採集）採樣揭示了驅動拷貝數變異（driver CNA）的趨同進化，因此同一驅動CNA涉及整個腫瘤中不同的親本等位基因。多區域多病灶採樣還可以比較原發灶，與原位復發、復發性轉移灶、淋巴結轉移等之間的關係，並確定轉移灶中的驅動基因。例如，肺腺癌出現腦轉移候，腦部病灶中MYC，YAP1和MMP13中的CNA與肺癌結節原發灶之間可以進行比較。儘管全基因組層面的測序數據如WGS和WES等手段，可以從廣度上可以幫助研究人員推斷出追溯譜系（retrospective lineage tracing），但微衛星在錯配修復（MMR）缺陷的結直腸癌中的高變異性是另一種被廣泛使用的標誌物，簡稱微衛星不穩定性（(Microsatellite Instability, MSI）。2020年NCCN指南中已經明確將MSI作為結直腸癌預後因子。
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微衛星不穩定MSI：
微衛星不穩定是由於腫瘤細胞基因組不穩定造成的一種特殊突變現象。微衛星序列指的是基因組上廣泛存在的短串聯重複，重複單元通常為1-5個鹼基。在基因組不穩定的情況下，微衛星位點在複製過程中出現滑動錯配，從而出現頻繁的拷貝數單元增加或者丟失，形成微衛星位點上的插入或缺失，這種情況稱作微衛星不穩定現象。基因組層面上的微衛星位點，早已被人們視為分子鐘，為克隆進化提供了重要的線索。例如，結直腸癌發生前的大腸腺瘤的分子年齡（molecular age）與腺癌相當，這是腺瘤到腺癌逐步發展的過程。
在最近的一項研究中，20個poly-G重複的微衛星位點在多區域多病灶分析中用於譜系追蹤，挑戰了「順序進展模型」（sequential progression model）。該模型假定先發生淋巴結轉移，再通過淋巴結轉移到遠端器官。這項研究表明，在三分之二的病例中，淋巴結轉移和遠處轉移均直接源於原發性結直腸腺癌，對解釋活檢樣品的分期具有明顯的意義。在此經驗的基礎上，針對微衛星位點採取了類似的方法，以證明在遠處轉移中，多克隆播種/接種（polyclonal seeding）在淋巴結轉移中更為頻繁。因此，對轉移性惡性腫瘤的分析可以進一步闡明克隆傳播的模式，並可以推斷出腫瘤進化的遷移模式。
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在腫瘤轉移過程中，癌細胞從原發灶遷移到轉移灶的過程稱作播種（seeding）。播種分為單克隆播種和多克隆播種，其中多克隆播種指的是攜帶不同突變的細胞共同遷移到了轉移病灶，導致轉移病灶天然地具有瘤內異質性和亞克隆結構。而通常來說，藥物作用等強大的選擇壓力會使得播種過程更傾向於單克隆，並且播種的克隆可能攜帶新的驅動突變和耐藥突變。
2.3 單細胞水平的遺傳史追蹤（Tracing genetic history in single cells）儘管多樣本/多重採樣為解構癌症進化的克隆型提供了較高的解析度，但仍需要從單個細胞水平的解析度解析系統發育，才能得出精確的克隆動力學和腫瘤的進化史。通過光學（免疫螢光FISH探針等手段）或單個細胞的條形碼高通量技術（以10X Genomics和BD為首的商業化單細胞測序平臺）進行的預期譜系追蹤，已經在技術上實現了在體內（in vivo）和體外（in vitro）對腫瘤進化建模，包括能夠捕獲其他細胞特徵的方法，如單個細胞的mRNA表達。
但是，上面提到的這些方法不適用於primary human tissues的回顧性譜系追蹤，而追溯這些「native barcodes」是關鍵。基於Droplet microfluidics微流控單細胞捕獲平臺，可以捕獲上萬個細胞的基因型信息（somatic genotypes）。對復發AML的驅動突變進行單細胞靶向DNA測序（single-cell-targeted DNA sequencing），以揭示急性期AML從診斷到復發的亞克隆轉變（subclonal shifts）。直接應用於人類癌症的回顧性譜系追蹤推斷的另一種方法是單細胞WGS（scWGS）。scWGS可以推斷出用作天然條形碼（natural barcodes）的CNA，通過該條形碼可以繪製單個細胞之間的系統發育關係。一項發表在2011年的乳腺癌單細胞測序研究闡釋了乳腺癌腫瘤組織中存在不同的克隆，並證明轉移灶是從單個克隆開始向人體其他部位進行擴增和接種的。具有腫瘤非復發特性的複雜CNA的單個細胞（Individual cells with non-recurrent complex CNAs），為研究人員提供了新視角，來研究促進克隆進化的潛在遺傳多樣性。近期的一些研究已經引入了高通量scWGS方法，可以對數千個乳腺癌細胞進行測序，並可以鑑定早期驅動基因（例如MCL1和MYC等，與亞克隆的擴增（例如RAD18）。scWGS的特徵在於SNV低覆蓋率，數量相對較少的somatic CNA限制了譜系重建的解析度。此外如上所述，在趨同進化的例子中，在單個腫瘤的兩個等位基因中都可以看到相同的CNA，因此請注意不要使用無限位點假設進行經典的系統進化重建（也就是說，用於譜系追蹤的突變不會回復突變，不會重複突變，新突變總是發生在之前未突變的位點上）。因此，具有「有限位點」模型的系統發育方法可能更適合解決非整倍體腫瘤。其他技術手段上的限制還包括對單細胞水平的基因組DNA進行全基因組擴增中引入的一些錯誤，如等位基因缺失，覆蓋範圍不均勻以及PCR錯誤等。目前一些課題組已經開發了新的生信工具，可以將經典的系統進化方法用於物種進化，以解決單細胞DNA測序數據中產生的噪音和錯誤信息。通過對單個細胞來源的克隆（single-cell-derived colonies）來增加DNA Input起始量，可以消除單個細胞全基因組DNA擴增所產生的錯誤。換句話說，增加同一個或同一類細胞的數量，就能增加同一細胞來源的DNA，以減少DNA擴增時產生的錯誤。對單個細胞克隆（single-cell colony）或類器官數據的高解析度譜系重建，已應用於正常的造血發育組織和癌組織研究。高解析度發育樹（high-resolution trees）為一些關鍵推論鋪平了道路。這些推論直接源自患者體細胞進化的一些關鍵參數信息，例如確定正常成年人自我更新的造血幹細胞池（self-renewing haematopoietic stem cell pool）的大小和增長率（rate of growth）。這項研究還開始將克隆動力學與譜系命運聯繫起來，表明人類成年造血幹細胞在140個已經被測序的單細胞克隆中貢獻了髓樣和B細胞（myeloid and B cells），但沒有貢獻T細胞。雖然該實驗的通量受到限制，但它提供了一個模型，用於追溯人類原始樣本中正常細胞和癌症幹細胞的遺傳譜系歷史以及命運決定的相關因素，並將其和轉錄組數據、表觀遺傳數據等其他組學中的基因突變信息相結合。
腫瘤進化過程中細胞狀態的異質性
Heterogeneity of cell states in tumour evolution
腫瘤內的遺傳變異性是腫瘤異質性的基礎，並提供了可遺傳的多樣性，可驅動整個癌症的克隆進化。然而，僅遺傳機制可能無法獲取完整的腫瘤內異質性的相關信息。長期以來研究人員就發現，這種變異性是由於單個腫瘤內細胞狀態的可塑性造成的。一個典型的例子是上皮組織類的惡性腫瘤中的上皮-間質轉化（EMT），這讓人聯想到胚胎發育過程中上皮細胞和間充質細胞之間的轉化。
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EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition）指的是上皮細胞轉化成具備間質表型的細胞的過程，這個過程廣泛地發生於胚胎發育、損傷修復和腫瘤惡變的過程當中。在腫瘤惡變過程中，上皮細胞通過EMT過程獲得了遷移能力，從而能夠從基底膜上脫出，轉移到其他不同部位。EMT是一種具備差異性的動態變化過程（a heterogeneous and dynamic disposition with intermediary or partial EMT meta-states），它由複雜的轉錄因子網絡進行調控，如SNAI1、SNAI2、ZEB1、TWIST1等。在臨床上，EMT與不同程度的浸潤、侵襲和轉移潛能（invasive and metastatic potential）相關。
更廣泛來說，如同在白血病、腦癌以及上皮腫瘤中所觀察到的那樣，癌症通常重現了正常的生理髮育程序（physiological developmental programmes），因此可能由幹細胞樣和分化的細胞類型（stem-like and differentiated cell types）組成。這些觀察到的結果繼而能夠支持產生癌症的分級/分層/分化模型（hierarchical model）。儘管在癌症研究領域仍存在爭議，但在該模型中，腫瘤幹細胞處於腫瘤分化最高等級。腫瘤幹細胞與正常幹細胞一樣，都有廣泛的增殖和自我更新能力（extensive proliferative and self-renewal capacity）。例如，未成熟型急性髓細胞白血病細胞顯示強大的繁殖能力，這種繁殖能力幾乎與白血病各種亞型都沒有任何關係，幾乎可以忽視各種突變驅動基因。與癌症始於具有幹細胞樣特性的細胞中的結論相一致，幹細胞樣程序的啟動已被一些研究證明發生在惡性轉化（malignant transformation）之前。具體來說，在BRAF突變和TP53突變的黑色素細胞（melanocyte）中激活胚胎神經嵴祖細胞狀態會誘導黑色素瘤的發生。這些結果表明，體細胞突變與幹細胞樣兩者之間協同作用會引發癌症。儘管這些研究為幹樣細胞的靶向治療提供了令人信服的證據，但腫瘤細胞的可塑性可能會使這一策略複雜化。分化的癌細胞表現出去分化成幹細胞樣的能力，使得惡性腫瘤細胞同時具備了分化和去分化幹細胞樣，這兩種狀態的雙重切換能力的可塑性。細胞狀態的隨機轉變也可以充當癌症抗性的媒介。通過對小鼠或體外培養的細胞進行藥物處理，能夠鑑定出少量因藥物處理而存活的細胞並監控獲取這些「稀有細胞」持續性的轉錄狀態。這種狀態因為藥物等外界選擇壓力的作用下獲得了驅動基因突變繼而對藥物產生耐藥性。例如將前列腺癌或肺腺癌轉化為小細胞癌，或通過Richter轉化將CLL轉化為瀰漫性大B細胞淋巴瘤，這種譜系可塑性（lineage plasticity）一直被認為是生產耐藥性的非遺傳機制。這種形式的譜系可塑性通過對細胞重編程提供了一種耐藥性的新途徑，從而消除了對治療靶向途徑的依賴性。總的來說這些證據表明，癌症進化是遺傳多樣性與癌症在細胞狀態之間進行切換的能力之間複雜相互作用的結果，這使得癌細胞群能夠迅速找到適合自己的最優進化軌跡和路線圖，從而能夠逃脫藥物幹預和其他治療方案對其的束縛。因此，需要將細胞狀態異質性與遺傳癌症進化模型這兩種方法整合在一起，解決這個難題。
3.2 單細胞解析度下的轉錄異質狀態（Heterogeneous transcriptional states at single-cell resolution）由於轉錄狀態異質性是腫瘤發生和進展的關鍵因素，因此原發性腫瘤的單個細胞RNA測序（scRNA-seq）已成為轉化醫學中常用的一種工具或手段。大量的泛癌/跨癌種研究表明，腫瘤內細胞狀態異質性已經成為一個約定俗成的準則和「共識」，不再是一種「意外發現」。細胞狀態的異質性不僅跟基本細胞過程相關（例如細胞周期，代謝和缺氧誘導的應激狀態），還跟發育跟耐藥相關。通過scRNA-seq技術對臨床腫瘤樣本進行測序，繪製了幹細胞樣和不同發育層次結構的高解析度單細胞圖譜。例如在IDH1/2突變的少突膠質細胞瘤中，scRNA-seq鑑定出具有神經幹細胞程序激活的幹細胞樣癌細胞，該程序位於層次結構的頂部，分支成兩個不同的細胞狀態，類似於星形膠質細胞和少突膠質細胞。與癌症幹細胞模型一致，細胞周期相關基因的表達在幹樣細胞中高度富集。在黑色素瘤的單細胞測序結果中，乾性信號與對RAF和MEK抑制劑的AXL高耐藥性程序相吻合，將關鍵特性（例如生長和對治療的耐藥性）直接對應到了同一細胞上。scRNA-seq能夠進一步檢測出治療後患者中的仍然駐留稀有癌細胞。基於治療性骨髓瘤的已知惡性特徵，對多發性骨髓瘤的治療前和治療後的scRNA-seq數據進行比較後，可鑑定出殘留的腫瘤細胞（通常佔漿細胞群的一小部分）。因此，scRNA-seq可以區分非腫瘤細胞中的稀有腫瘤細胞，以對疾病進行早期篩查，或鑑定出殘留的少量癌細胞並迅速錨定可能會產生耐藥的細胞。此外，scRNA-seq不僅可以在既定的時間範圍內測量細胞狀態，而且新開發的生信工具還可以利用scRNA-seq數據來模擬細胞狀態的動態變化軌跡。基於轉錄數據中相似性梯度的推論，已經出現了各種算法來重構細胞的分化軌跡，這種分析被稱作是擬時序分析或偽時序分析pseudotime projection analyses。例如R包Monocle能夠生成構造了最小的生成樹（spanning trees），將單個細胞mapping到主幹上。常規的細胞生物學研究要分離特定的細胞，需要針對該細胞的表面蛋白定製特異性抗體。該算法的優勢在於，scRNA-seq數據中的細胞本身不依賴於基於已知細胞表面marker蛋白，因此可以捕獲細胞的一些過渡狀態，有助於研究人員判斷細胞狀態動態變化。另一種算法則通過scRNA-seq中未剪接的mRNA與已剪接的mRNA的比例來確定RNA速率，即RNA velocity。通過mRNA豐度的變化率，來預測未來的細胞狀態。由於「打開」的基因比「關閉」的基因具有更高的比率，因此RNA速率可以預測細胞所假定的轉錄譜，從而可以預測未來的細胞狀態並測量當前的細胞狀態。這兩種方法都能夠對正常組織和癌組織中細胞狀態動態進行監測。值得注意的是，這些方法與遺傳譜系追蹤無關，因此通過單細胞多組學整合將細胞狀態動態與遺傳同一性聯繫起來，這個前景相當誘人。從而闡明了體進化中細胞狀態動態的遺傳基礎。
3.3 遺傳譜系歷史與單細胞轉錄狀態關聯（Coupling genetic lineage history with single-cell transcriptional states）用不同的表型變異（例如沿著developmental hierarchies或治療後產生的耐藥性）來追蹤癌細胞的譜系歷史，需要將遺傳信息與scRNA-seq數據直接整合。例如通過將患者的病灶移植到異源物種如小鼠體內如PDX等，這些移植的組織或細胞用慢病毒轉入了一些條形碼信息。具有相同條形碼（即源自同一細胞）的腫瘤細胞佔據不同的譜系特異性狀態，從而證實了膠質母細胞瘤細胞的可塑性。但是這種工具不能用於primary human tissue，而需要用到體細胞突變基因條形碼信息。
目前已經有一些課題組開發了在單個細胞中整合DNA和RNA表達的實驗方法。例如，G＆T-seq可以通過提取和分離基因組DNA和mRNA進行擴增和測序來捕獲單細胞基因組信息和所有mRNA的轉錄組數據。另一種方法sci-L3使用組合index提高了雙重測定的通量。如上所述，這些技術具有跟scWGS的相同局限性，例如測序數據和算法可拓展性差（scalability），測序數據本身的稀疏性（sparsity）、PCR錯誤（PCR errors）和等位基因缺失（allelic dropouts）。scWGS的應用對於大部分整倍體惡性腫瘤的所能提供的幫助比較有限，因此靶向測序可能會提供更多信息。儘管如此，這些方法可以將遺傳譜系歷史與同一細胞中的非整倍體腫瘤的表型狀態聯繫起來。
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scalability字面意思上解釋為可拓展性，實際上在高通量測序以及計算機科學裡面，scalability泛指那些計算能力進行彈性拓展和算力提升的一種狀態。Scalability is the property of a system to handle a growing amount of work by adding resources to the system。但是在本文負面語境中特指lack of scalability的意思，意思是可拓展性差。sparsity字面意思上可能直接可以翻譯成稀疏性，在人工智慧領域泛指那些需要處理的數據稀疏化，如降低複雜度正則化。或者部分神經網絡裡面的參數過於複雜，需要對模型中過於複雜的參數進行簡化達到模型稀疏性的目的。這就導致在單細胞測序領域這個解釋有所不同。只要測的細胞較多，而每個細胞的轉錄本又較多，這個現象總會存在。在單細胞中通常和dropout聯繫在一起，意思就是測不準。在表示轉錄本豐度的矩陣中，對象和屬性都很多，每增加一個只有少量屬性值的對象，就會帶來大量的零值。此外，通過評估跨染色體的基因表達的不平衡，轉錄組本身豐富遺傳信息已被用來推斷CNA的大量擴增和丟失。在這些非整倍體癌症的早期標誌性單細胞研究中，這種方法使得能夠研究克隆與發育狀態之間的聯繫。
在少突膠質細胞瘤中，儘管可以在不同的細胞狀態中鑑定出亞克隆的傾斜富集，但克隆差異與主要細胞狀態不符。在膠質母細胞瘤中，特定拷貝數的增加（例如分別在EGFR，CDK4和PDGFRA中的拷貝數增加）促使腫瘤細胞向星形細胞、神經祖細胞和少突膠質祖細胞狀態發生轉換。此後一些改進的生信算法已經整合了用於複製中性雜合性丟失（copy-neutral loss-of-heterozygosity events）的SNP，以及CNA的整體基因表達水平。這些方法在分析多發性骨髓瘤中，將初始癌細胞中的亞克隆缺失del16與類似於復發性髓外骨髓瘤細胞的轉錄特徵聯繫起來，表明腫瘤的侵襲性與原始腫瘤中亞克隆驅動因子之間的潛在聯繫。通過Smart-seq2 protocol，將SNV驅動基因信息與scRNA-seq數據進行整合，可獲取全長轉錄本。已知在34％的腫瘤細胞中促癌組蛋白H3K27M中都發生了突變。得益於Smart-seq2的polyA擴增方式，與未聚腺苷酸化（non-polyadenylated）的HIST1H3B相比，聚腺苷酸化（polyadenylated）的轉錄本H3F3A的效率更高。接下來通過在Smart-seq2原有的protocol中添加H3F3A突變基因座特異性引物（44個分析細胞中的97％），顯著改善了檢測效果。目前已經開發出與Smart-seq2的類似方法，將BCR-ABL陽性CML幹細胞的基因改變和轉錄狀態聯繫起來，以追蹤和揭示TKI抑制劑治療效果。總而言之，這些研究表明，克隆差異與細胞狀態異質性保持著複雜的關係，不同類型的腫瘤之間存在差異。進一步表明需要以更高的通量將遺傳信息與單細胞水平的轉錄狀態進行整合。
3.4 單細胞轉錄組中的體細胞基因分型（Somatic genotyping in high-throughput single-cell RNA-seq）由於Smart-seq2較低的通量和reads覆蓋較低，上述研究中的體細胞基因分型效率很低。而通過對基因組上的DNA和cDNA進行靶向擴增的高靈敏度的體細胞基因分型，能夠在慢性髓樣腫瘤（chronic myeloid neoplasms）整合克隆結構和轉錄狀態。基因組DNA擴增的另一個優勢是對低表達或未表達突變的基因分型進行鑑定。儘管此方法是在Smart-seq2 protocol基礎上改進的，但通過開發384孔板可生成3'轉錄組文庫，其通量由原來Smart-seq2的1個細胞提高到了數千個細胞。每個細胞最低30,000到50,000個reads，部分文獻每個細胞達到了0.2M 個reads。10X Genomics的單細胞轉錄組也推出了SNV的檢測，每個細胞至少大於20,000個reads。這種方法提供了一個框架來解析AML的亞克隆轉錄身份，例如GATA2突變的亞克隆。本綜述作者和其他課題組對傳統的基於納米孔scRNA-seq平臺進行了改進，通過靶向擴增感興趣的突變基因barcode cDNA，在成千上萬的單細胞中與全轉錄水平的mRNA一起，能夠實現高靈敏度的體細胞突變信息捕獲。van Galen等人利用基於納米孔的scRNA-seq技術，在AML中實現了靶向的體細胞基因分型鑑定。這些數據已經證明，反映造血分化狀態的AML轉錄身份與潛在的遺傳驅動因素密切相關，與前面提到的膠質母細胞瘤的基因型和細胞狀態非常相似。
例如，在原始祖細胞狀態中，FLT3內部串聯重複（internal tandem duplications）與在同一腫瘤內分化細胞中的FLT3 Asn841Lys突變緊密相關。儘管納米孔的通量能夠實現數千個細胞的轉錄組分析，但由於目標基因的表達水平較低，且目標基因位置與轉錄本末端距離較遠（例如10X Chromium只能捕獲3』端的部分mRNA信息），大多數目標基因突變位點捕獲的效率較低。但是，同時捕獲全轉錄組信息可以通過隨機森林分類器（Random forest classifier），基於基因型細胞和非基因型細胞之間的轉錄相似性推斷突變狀態。作為一種替代方法，本文作者基於10X Genomics平臺開發了轉錄組基因分型（GoT）技術。GoT能夠在數千個細胞中進行高度敏感的基因分型鑑定，靶向CALR驅動基因中主要的體細胞突變基因分型效率約為90％。儘管如此，由於10X技術本身的限制導致無法獲取全長mRNA，這就使得目標基因區域與3』末端之間的距離限制了某些目標基因分型的鑑定。為了克服這一局限性，作者引入了兩種補救的方法，包括long reads測序和GoT環化建庫，其中連續幾輪的環化和反向PCR，能夠去除靶向區域序列和細胞barcode序列之間的插入序列，換句話說這2個補救方法能夠把不必要的序列給去除，從而產生了可以用於標準分析流程的短reads測序。作者還注意到，由於對scRNA-seq中的對mRNA pooling進行擴增時容易產生偏好性，如上圖所示，由於PCR擴增不僅容易產生非線性擴增還容易在PCR過程中引入錯誤，這就是導致對突變信息可能被錯誤地指定為野生型。於是作者引入了UMI分子標籤。作者還系統地檢查了基於基因型的發現與改變最小UMI計數閾值之間的關係，以評估結果的穩健性。雖然GoT在檢測低表達基因上仍然面臨諸多的挑戰，但對scRNA-seq平臺優化仍在繼續，提高總體RNA捕獲效率將提高基於cDNA的基因分型鑑定的概率。
GoT在高通量下共同捕獲細胞狀態和基因型信息的能力表明，在CALR突變的骨髓增生性腫瘤中，造血祖細胞的主要轉錄信息與體細胞突變狀態不相關。也就是說，突變細胞和野生型細胞混合在整個造血分化樹中，這證實了精確的基因分型對於區分突變體和野生型細胞的重要性。
因此，在這種情況下，GoT能夠將突變分化軌跡疊加到同一個體內造血發育的正常圖譜上，從而消除了潛在的生物學混雜因素和技術批次效應。對突變和野生型分化細胞圖譜的直接比較發現，突變細胞的頻率隨著髓樣分化的增加而增加，表明差異適應性優勢是祖先身份的功能。為了證實這一結果，作者將擬時序分析與細胞的遺傳圖譜進行了整合，並證明與野生型細胞相比，突變的細胞偏向分化狀態。與造血幹細胞相比，在分化的祖細胞如巨核細胞祖細胞中突變相關的細胞周期基因表達增加更為明顯。突變誘導的未摺疊蛋白應答，NF-κB活性和JAK-STAT信號轉導均隨祖細胞類型和成熟階段而變化，表明潛在的細胞特性限制了驅動突變的影響以及由此產生的癌症細胞表型是細胞身份與體細胞突變之間相互作用的功能。這種方法在研究人組織中的早期克隆擴增中可能特別有用。最近，在全身都發現了形態正常組織內的克隆擴增，導致了體細胞嵌合體現象（mosaicisms）。在環境壓力下皮膚、食道和肺等上皮細胞比較豐富的組織中，這些克隆通常在已知的一些驅動基因如TP53和NOTCH1中帶有體細胞突變。類似地在造血系統中，經常在正常的個體中以低等位基因頻率證明骨髓惡性腫瘤的復發性驅動基因突變，例如DNMT3A和TET2突變。這種狀態被稱為「克隆性造血功能」，但使這些人更容易患上血液癌和心血管疾病。然而，對於這些突變的克隆表型產生的表型後果，仍然存在一個關鍵問題。因此，將多組學技術應用於這些其他可能正常的組織，有助於識別最早期克隆異常生長的信息。將高靈敏度的體細胞基因分型鑑定技術，擴展到更多的基因位點還可以實現對克隆的重建，高解析度追溯譜系追蹤（high-resolution retrospective lineage tracing）並與細胞身份和細胞狀態信息相整合。為此，任何突變信息，如線粒體DNA或微衛星位點中的突變，都可以用於譜系標記。將這些天然存在的遺傳條形碼信息整合到多種單細胞測序的組學技術中，可以提供高解析度的系統發育數據和細胞發生細微狀態變化的數據，最終使我們能夠破譯癌細胞命運的密碼。
癌症進化中表觀遺傳的可塑性
Epigenetic plasticity in cancer evolution
4.1 表觀遺傳學的基礎是細胞狀態（Epigenetic profiles underlie cell states）前文提到的致癌表型，例如持久性（persistence）、自我更新和譜系可塑性等，需要不斷遺傳給後面的細胞，才能促進癌症向進展和耐藥方向演變。但是，這些細胞狀態經常被證明在遺傳性存在不一致的情況。越來越多的數據表明，細胞狀態可以在表觀遺傳層面進行編碼和繁殖，這與正常發育生物學中細胞身份的表觀遺傳編碼（epigenetic encoding）是一致的。 表觀遺傳學包括DNA甲基化、染色質開放程度和組蛋白修飾，主要通過關鍵轉錄因子來激活介導。總體而言，表觀遺傳修飾引起轉錄活性的高度協調調節，這對於組織的正常發育至關重要。
血液腫瘤中表觀遺傳修飾基因（如TET2、DNMT3A和ASXL1）和實體腫瘤中SWI/SNF（BAF）染色質複合體，普遍存在大量突變，這表明表觀遺傳學在介導腫瘤發生中具有重要意義。另外，一些生化機制研究揭示了表觀遺傳學在persistence和發生耐藥的潛在轉錄特徵。在膠質母細胞瘤中，腫瘤幹細胞顯示出H3K27me3的整體重構，並且與Notch信號傳導和靜默相關的用於激活增強子的組蛋白H3K27ac在部分病灶中表達增加。在雌激素受體陽性（ER positive）乳腺癌中，KDM5組蛋白脫甲基酶的表達增強了轉錄異質性和耐藥性。因此，越來越多的證據表明表觀遺傳編碼對癌症細胞狀態的重要性。
4.2 表觀遺傳崩塌激活腫瘤可塑性（Corrupted epigenetic identities enable tumour plasticity）從第一個轉化的細胞忠實地傳播表觀遺傳身份，從而可以推斷出起源細胞類似於祖先癌細胞遺傳信息的忠實傳播。儘管如此，表觀基因組在不斷增長的惡性癌細胞群體中也在多樣化信息。因此，正如基因組中的隨機突變導致遺傳性腫瘤的異質性一樣，表觀基因組中的隨機突變會產生表觀遺傳的瘤內多樣性。這種結果是基於前期大量的DNA甲基化研究得出的。這些研究表明，成千上萬個鹼基位點表現出「嘈雜」隨機模式，代表了正常細胞和癌細胞表觀基因組中可遺傳的巨大差異。在這些研究的基礎上，對原發癌組織的檢查表明，腫瘤細胞與基因進化都表現出DNA甲基化水平的多樣化。對前列腺腺癌的原發灶、轉移灶和癌前病變的多個組織區域搜集樣本，通過DNA甲基化異質性進行的譜系追蹤密切反映了基於拷貝數遺傳多樣性建立的系統發育關係，並構建了進化樹。同樣，在結直腸癌模型中，對單細胞來源的結腸癌類器官的DNA甲基化分析顯示，與遺傳多樣性相似，DNA甲基化異質性能夠穩定傳播。大規模CLL隊列樣本DNA甲基化測序結果證實，腫瘤內DNA甲基化的異質性高於正常B細胞。多個相互協調的表觀遺傳層，能夠調節基因表達和細胞身份，早期數據表明表觀遺傳多樣化超出了DNA甲基化的水平。例如，表觀基因組各層之間的協調遭到破壞，導致共同mapping到相同的基因組位點，後者通常在CLL中專門激活和抑制組蛋白修飾，這可能反映了組蛋白修飾中的細胞間多樣性，並與更大的轉錄多樣性相關。重要的是，最近的證據支持這樣一種觀點，即選擇可能對表觀遺傳多樣性起作用，類似於公認的克隆進化遺傳多樣性模型。在IDH突變型神經膠質瘤中，CTCF絕緣子蛋白結合motif的隨機超甲基化導致增強子和基因之間的絕緣（insulation）喪失，這可能被強行控制為致癌基因激活的機制。
相反，通過啟動子高甲基化或多梳蛋白polycomb介導的抑制，異常限制性狀態可以抑制分化程序的誘導，從而將癌細胞停滯在增生狀態，如EZH2突變的B細胞淋巴瘤所示。最後，通過表觀突變的過程破壞了表觀遺傳編碼（例如，隨機DNA甲基化變化）可以降低細胞狀態之間轉換的障礙。這種現象可能是惡性腫瘤可塑性增強，破壞分化等級並促進諸如去分化為幹細胞樣等過程的基礎。這種可塑性分化拓撲結構已經通過數學模型顯示出來，可以放大陽性選擇，從而擴大癌症的進化能力。綜上所述，表觀遺傳信息作為關鍵細胞狀態的重要遺傳信息而出現，因此可以為選擇和進化提供額外的作用機制。
4.3 多組學技術整合單細胞遺傳/表觀/轉錄信息（Multi-omics technology links genetic, epigenetic and transcriptional information in single cells）目前全球各地實驗室正在開發新的生信算法和新的實驗方法來捕獲單細胞中的表觀信息和細胞狀態信息，如同一細胞進行蛋白和轉錄信息的捕獲。整合了蛋白質表達的scRNA-seq和單核染色質開放程度檢測（ATAC-seq）已在同一癌症樣品上並行進行測序，根據染色質開放程度推斷分析了轉錄狀態與調控網絡失調之間的聯繫。在混合譜系雙表型白血病（在同一白血病中具有髓樣和淋巴樣分化的標誌物）中，將腫瘤細胞mapping到具有mRNA和ATAC-seq數據的正常造血分化圖可以將轉錄因子激活與其下遊靶點建立因果聯繫，如RUNX1上調CD69。此類分析或實驗結合的雙高通量scRNA-seq和ATAC-seq方案（如sci-CAR）的進一步應用，可能有助於識別精確的順式調控位點和靶基因，並確定關鍵的調控網絡控制克隆進化。基於Smart-seq2 protocol基礎上進行修改後，可以對同一細胞來源的DNA甲基化信息和mRNA轉錄組信息進行同時捕獲。一種方法是將scTrio-seq用於肝癌和結直腸癌的多區域採樣，以在轉錄和甲基化狀態的背景下追溯癌細胞的遺傳譜系歷史。在結直腸癌中，甲基化圖譜與CNA定義的遺傳譜繫緊密相關。儘管轉錄程序與啟動子的甲基化呈負相關，但正如預期的那樣，轉錄狀態與亞克隆遺傳特性並不一致。將DNA甲基化和整個轉錄組數據連結到單個CLL細胞中，發現細胞間甲基化變異與基因表達變化密切相關。因為每個細胞捕獲約10％的目標甲基化組的捕獲率，儘管單細胞基因組數據中稀疏性的局限性，在單細胞亞硫酸氫鹽測序數據中也遇到了相應的瓶頸，但DNA甲基化的整體變化為克隆進化等提供了寶貴的見解，例如測量表觀層面變異的能力。值得注意的是，可遺傳的DNA甲基化突變也可以作為分子鐘，因此可以用作天然條形碼，直接推斷原發性CLL樣品中腫瘤細胞的高解析度系統發育史。體細胞基因分型在此多組學方法中的進一步整合應用於亞克隆SF3B1突變，這表明突變的細胞聚集在基於DNA甲基化的系統發育樹的一個進化枝中，具有不同的轉錄輸出，為樹推斷提供了正交驗證，並能夠進行估計SF3B1突變獲得時的淋巴結年齡。最終，轉錄信息直接在譜系樹上的多組學投影揭示了暴露於不同進化枝中不同途徑的治療性暴露。儘管聯合單細胞表觀遺傳多組學平臺在癌症上的應用仍處於起步階段，但這些數據突顯了將各種可遺傳但可塑性的癌細胞單細胞整合用於跟蹤（並最終預測）克隆進化的希望。
細胞空間動態與腫瘤微環境
Spatial dynamics and the microenvironment
5.1 細胞空間動態是腫瘤異質性的遺傳來源（Spatial dynamics as a heritable source of tumour heterogeneity）細胞空間定位代表與適應性相關（associated with fitness）的腫瘤細胞進化中的另一個可遺傳的維度（heritable dimension），因為腫瘤細胞傾向於與其親本細胞（parent cells）定位在一起，並且其生長程度受到了一定限制。
例如，在某些情況下，實體瘤中邊緣的細胞會處於一個活躍的細胞周期（「邊界約束」生長boundary-bound』 growth），這表明空間限制是與轉移潛能和生存相關的重要的可遺傳性特徵。最新數據表明，腫瘤細胞的空間分布不僅與適應性（fitness）有關，而且與克隆進化有關。與同一尺寸的惡性前腺瘤形成鮮明對比的是，同一腫瘤內單個腺體（由<10,000個細胞組成）的多區域多部位採樣結果，進一步顯示了結直腸癌中的多種克隆高度混合，這證明了克隆身份的分離（segregation of clonal identities）。與這些數據一致，數學模型算法模擬的預測結果，確定了腫瘤細胞的克隆混合是結直腸癌的早期事件。因此，類似於癌細胞的表觀遺傳學特徵的持續崩壞/失控（corruption），組織結構的破壞（breakdown）可能是克隆進化的關鍵特徵，因為即使微小的細胞擴散也會增加腫瘤的適應性及其對當下需要面臨關於治療方案的挑戰。值得注意的是，儘管白血病不受組織在空間上的嚴格限制，但骨髓本身的混亂無序（disorganization）是髓系腫瘤的長期存在的一個現象和特徵。因此，組織結構的畸變是實體瘤和血液惡性腫瘤之間進展的共同特徵。腫瘤進化過程中的空間嵌入（Spatial embedding）還會導致不斷增長的惡性癌細胞群體所在腫瘤微環境的相互作用。在所有癌症中，包括免疫細胞，內皮細胞和基質細胞在內的腫瘤生態系統已被證明是癌症轉移、進展和對治療應答的關鍵決定因素。近期一項研究揭示了一個令人驚訝的現象，非小細胞肺癌以與特定免疫微環境高度相關的方式，通過啟動子甲基化或CNA調節新抗原的表達以進行免疫逃逸。同樣，在惡性程度較高的晚期卵巢癌中，進行多區域多病灶部位採樣後觀察到腫瘤與免疫細胞的相互作用，表明與腫瘤相關的T細胞與克隆異質性呈負相關，傾向於選擇具有免疫逃逸機制的克隆。這些研究表明，在相同的惡性癌細胞種群中，在基因組或表觀基因組水平上可遺傳的進化變化，會隨著與非惡性細胞相鄰的局部相互作用而變化。具體而言，這些研究表明，腫瘤微環境正在對亞克隆施加選擇性壓力，並積極促進癌症的進展。
5.2 單細胞水平解析度的腫瘤微環境（The tumour microenvironment at single-cell resolution）雖然上述對原發灶腫瘤臨床樣本的大量多組學分析，為腫瘤微環境對進化過程的影響提供了有力的支持，但腫瘤微環境的細胞複雜性要求單細胞分析以提供其與腫瘤相互作用的高解析度圖。頭頸癌scRNA-seq測序結果中，鑑定了具有部分EMT程序的腫瘤細胞與基質劃分/基質間隙（stromal compartment）之間的相互作用。最近scRNA-seq也證明了腫瘤微環境的複雜性，揭示了大量支持免疫逃逸的免疫微環境偏好性等相關證據，例如通過對轉移性黑色素瘤多細胞微環境中分離的T細胞來支持免疫逃逸理論。實際上，單細胞測序已經在免疫學和免疫腫瘤學領域發生了變革。然而，對免疫細胞生物學的深入討論超出了本文範疇。然而，由於scRNA-seq通常需要對新鮮組織進行解離，因此不能保留腫瘤細胞和微環境的結構信息。儘管如此，仍可以通過關聯已知配體和受體的表達，從scRNA-seq推斷出細胞間的相互作用。雖然已經有開發了大量分析工具來預測高度結構化的組織結構的空間排列，但高度混亂的癌組織可能對基於解離樣品的scRNA-seq進行推論更具挑戰性。
5.3 單細胞空間識別/可視化技術檢視腫瘤微環境（Examining tumour microenvironments with spatially aware single-cell technologies）在腫瘤微環境的研究中，具有在空間水平檢測單細胞的技術平臺可能會產生革命性突破。對於蛋白質檢測而言，使用同位素（如質譜細胞成像IMC和離子束成像MIBI圖像），或螢光團（如多重免疫螢光MxIF和循環免疫螢光CycIF）進行多重標記可以檢測細胞或亞細胞解析度上的數十種標記。當這些工具應用於腫瘤臨床樣本後發現，腫瘤內呈現出顯著的異質性，包括與空間位置相對應的信號通路改變。通過免疫螢光技術，如莊小威發明的merFISH單細胞成像技術以及seqFISH等用於檢測單個細胞中的mRNA信息。此外利用FISSEQ和STARmap擴增cDNA的原位RNA測序已將目標基因增加到數百個基因。利用UMI技術檢測mRNA分子的空間轉錄平臺極大地拓寬了研究維度，之後將這些數據與高通量scRNA-seq平臺進行聯合分析，從而可以基於空間模式化的基因表達將來自scRNA-seq數據的分離細胞重新對應到其空間位置。通過整合目標mRNA分子的原位雜交，從而擴展了IMC平臺，同時在單個細胞水平實現了蛋白表達和基因表達，從而可以確定RNA與蛋白質表達的相關性。例如，在乳腺癌中，HER2基因和蛋白質表達高度相關，而CK19顯示蛋白質與相應基因水平之間的相關性較弱。相同的方法鑑定了在與T細胞相關的腫瘤細胞中表達的T細胞募集細胞因子CXCL10，從而對腫瘤免疫細胞有了更加深入的了解。目前還有其他課題組相繼開發了許多生信分析工具，以量化關於空間定位和細胞間相互作用的細胞內源性與環境性因素相關的基因表達或蛋白質表達。這些細胞空間技術平臺的應用會與高通量單細胞多組學結合在一起，有望增進人們對細胞間相互作用和空間位置的理解。
討論與展望
Conclusions and perspectives
腫瘤進化包括遺傳水平、細胞狀態水平、表觀遺傳水平，空間水平和腫瘤微環境因素的複雜相互作用。最近，新開發的多組學技術已開始在單細胞水平的解析度上有所突破，能夠整合腫瘤進化上的一些遺傳因素和非遺傳因素。
這些方法通過對臨床樣本的研究，為解決有關癌症進化的核心問題鋪平了道路。例如，相對於細胞在克隆擴增能力上的退化，需要鑑定出促使細胞出現惡性轉化的驅動因素，就要求具有對細胞進行基因型分型鑑定的能力，並搜集到驅動突變引起的轉錄狀態和表觀遺傳狀態的相關變化信息。惡性腫瘤研究的另一個開放領域是評估腫瘤幹細胞的家系命運的決定因素（lineage fate decisions），這些決定因素最終取決於體細胞突變與細胞狀態的相互作用。這些細胞狀態可能反過來由內在因素（表觀遺傳）或外在因素（環境因素）影響，強調了單細胞多組學整合分析的重要性。正常組織（normal tissue）中的惡性腫瘤和克隆擴增的單細胞多組學聯合分析，可能有助於揭示潛在的模型。在該模型中，多細胞人宿主（multicellular human host）能夠抑制兇猛無序的細胞進化過程。近期測序數據中，人類正常組織的體細胞驅動因子突變的普遍表明，遺傳限制/遺傳約束（genetic constraints）可能需要與其他機制協同行動以抑制體細胞進化。所謂的遺傳約束指的是多個驅動突變時間累積所需要的時間。這個機制就涉及到細胞在空間上的位置與限制。例如在結直腸的隱窩下，該隱窩通過將結直腸中的幹細胞總群分裂為孤立的生境（isolated habitats）而減少了有效群體大小，從而有利於遺傳漂移而不是遺傳選擇。惡性腫瘤進展加上腫瘤細胞在空間層次上更為複雜的結構，會將選擇性擴大並對藥物產生耐藥性。另一種這樣的機制可能是基於複雜的層次結構。這些概念的提出在部分構建的數學模型中得到了驗證，腫瘤進化樹反映了多樣化的分化層次結構，並對人體組織正向選擇有抑制作用（suppresses positive selection）。相反的是，當癌症中DNA甲基化「表觀遺傳封印」（epigenetic identity barriers）逐漸被解鎖後，與其相關的去分化模式可能會起到反作用，從而導致腫瘤進化樹上正選擇（positive selections）變多。值得注意的是，這些分化層次可以通過外部編程或內部編程的方式來實現。外部編程包括利用細胞因子刺激上皮細胞較多的組織，內部編程包括對骨髓等空間限制不多的組織進行表觀層面的操作。
· 知識拓展 ·
進化過程中，環境產生的選擇壓力會對新發的突變產生不同的選擇作用，其中正選擇指的是新發生的突變傾向於使個體產生更適應環境的性狀，生存能力提高，從而攜帶該突變的個體在群體中的佔比上升。在腫瘤的進化上，攜帶驅動突變的細胞會在此過程中獲得更加有助於癌細胞生長生存的特性，從而展現出正選擇的過程。
由於克隆產物是突破體細胞進化障礙（barrier）的第一個關鍵步驟，因此他們傾向於影響上皮組織中與細胞因子相關的機制如Notch與Wnt通路上相關基因突變，以及造血器官中的DNA甲基化修飾等。於是，不斷增長的克隆可以作為腫瘤進化過程中非常「優良的底物」，最終導致惡性腫瘤相關克隆勝出，佔據主流。
換而言之，設想單細胞多組學技術應用場景拓展到整個人體組織的進化，為人體基本系統特徵（basic system properties）提供了諸多關鍵線索。這些特徵阻止了億萬細胞廢除自身多細胞契約（multi-cellular contract），以犧牲宿主本身為代價做適應性優化。
這些藉助多種技術手段的整合分析可以對體細胞演化進行多層次的解析和探究，從而深入多細胞物種演化和單細胞物種無性生殖之間的交叉領域，在這一令人興奮的交叉點得到新的重大突破。
韓斐然，浙江大學生物學博士，聯川生物10X單細胞5』 VDJ免疫組測序及DNA重測序組負責人，統籌日常實驗與生信工作。擅長領域為腫瘤異質性與克隆演化，對腫瘤進化有獨到的見解，並自主開發歐氏距離生信算法用於腫瘤異質性分析。目前在bilibili聯川生物主頁開設文採斐然文獻解讀專欄，每周三期，解讀CNS期刊中的最新研究
沈勵澤，聯川生物高級產品經理，市場部負責人，在NGS領域有多年從事數據分析和產品開發經驗。目前負責公司高通量測序產品開發與售前技術支持工作，主持開發m6A甲基化測序並撰寫書籍《RNA甲基化修飾m6A研究一本通》。同時參與協助腫瘤外顯子、單細胞測序等產品的相關開發工作。
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