近10年，長非編碼RNA（Long noncoding RNAs, lncRNA）的研究熱度節節攀升。國自然項目中，lncRNA的中標項目數也不斷增加，成為國自然數一數二的熱點之一。如果你對2020年的國自然申請還沒有方向，那麼這個熱點值得你考慮一下。
圖1. 以lncRNA為關鍵詞，lncRNA歷年中標項目數
（來源: medsci.cn）
lncRNA，是指長度大於200核苷酸的非編碼RNA。大量研究表明，lncRNA參與了從基因表達到蛋白質翻譯和保持蛋白穩定等細胞機制，在發育、機體內平衡和維持細胞命運中發揮重要作用，lncRNA的異常表達與包括癌症和心血管疾病等多種疾病密切相關，因此提供了新的生物標誌物和藥物靶點。
圖2. lncRNA參與基因表達調控，可以通過多種類型的lncRNA調控來調節基因表達
隨著高通量測序、lncRNA晶片等技術的發展，越來越多的 lncRNA被鑑定出來，但具體的作用與功能仍然不是很清楚。通過不斷發現新的lncRNA以及對已知lncRNA進行更徹底的表徵研究可能會豐富lncRNA的分子機制及生物功能，因此 lncRNA依然具有極大的研究價值。
研究lncRNA的經典策略
1. 篩選lncRNA
通過lncRNA晶片或RNA測序等方法對樣本進行高通量篩選。
2. 表達分析
篩到表達差異最顯著的lncRNA，通過qPCR或RNA原位雜交對候選lncRNA驗證，檢測lncRNA在不同細胞或者組織中的表達水平和定位。
3. 功能研究
研究基因功能的常規策略是用功能獲得/缺失實驗進行表型分析，通過細胞和動物實驗進行驗證。
4. 機制研究
lncRNA可與蛋白質、DNA和RNA相互作用，實現多樣化功能。因此，可通過與其互作的分子探討其功能與作用機制：
A. 與蛋白質相互作用：鑑定lncRNA的蛋白質伴侶可為其功能機制和途徑提供線索。例如RNA免疫沉澱（RIP）技術與高通量測序結合使用，以鑑定與lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質因子，儘管需要通過機理研究進一步驗證。
B. 與DNA/RNA相互作用：已有多種技術被用來鑑定lncRNA靶向的基因組位點。基於染色質免疫沉澱（ChIP）和RIP的原理，染色質RNA免疫沉澱（ChRIP）可用於鑑定與特殊染色體標籤相互作用的RNA。另一方面，可通過ChOP、ChIRP、CHART等技術使用標記的互補寡核苷酸來鑑定與目標RNA相互作用的DNA位點。
C. 結構特徵：lncRNA可以形成特定的二級（鹼基配對）和三級（三維）結構來執行其功能。可採用RNase footprinting，Chemical Mapping，in-line Probing和SHAPE (selective 2』-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技術研究其功能域。
圖3. 研究lncRNA作用機制的方法
客戶研究案例分析
原文標題：Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis
期刊：Nature Communications
研究策略：
Step 1 lncRNA篩選
研究人員通過晶片篩選、不同的肌肉組織的表達鑑定以及mRNA的功能富集實驗後，研究人員找到了與肌細胞生成相關的lncRNA，命名為lnc-mg。
圖4. 晶片篩選肌生成相關的lncRNA以及驗證
Step 2 lnc-mg功能分析
敲減和過表達（體外實驗）
對lnc-mg進行敲減和過表達。結果顯示，敲減後，MuSCs的分化受到抑制，其分子標誌MyHC表達降低，肌小管數量減少；過表達後，MuSCs分化加強，肌小管數目增加。
圖5. lnc-mg的敲減和過表達
體內實驗
研究人員構建了lnc-mg敲除小鼠模型和轉基因TG模型，分別檢測腓腸肌（GAS），比目魚肌（SOL），伸縮肌（EDL）和脛骨前肌的形狀變化，檢測發現lnc-mg敲除小鼠的肌肉重量變輕，體積變小，而TG小鼠的肌肉組織變重變大；此外，兩種肌肉的僵直機能和運動能力也完全相反。這些體外和體內實驗驗證了lnc-mg是影響肌生成的重要lncRNA。
圖6. lnc-mgskl －/－小鼠的形態學和功能變化
圖7. lnc-mg轉基因小鼠導致肌肉肥大
Step 3 lnc-mg機制研究
通過miRNA晶片篩選，從ceRNA角度進行驗證。
通過晶片檢測了過表達和敲減細胞的miRNA表達變化，發現miR-125b在過表達細胞中下調，在敲減細胞中上調。結合生物信息學結果分析得出：miR-125b是lnc-mg實現ceRNA機制的潛在靶點。此外，螢光素酶檢測也證實了lnc-mg能結合miR-125b並影響其表達。
目前已有研究顯示，miR-125b通過調控靶基因Igf2影響成肌細胞分化。因此，研究人員檢測了過表達和敲減lnc-mg細胞中Igf2的表達，Western Blotting和ELISA結果表明Igf2蛋白表達分別增加和減少。進一步的螢光素酶和小鼠轉基因模型實驗也都清晰地表明，lnc-mg是通過競爭性地結合miR-125b影響Igf2的表達，從而影響肌細胞生成。因此，lnc-mg是通過典型的ceRNA機制影響肌生成。
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參考文獻：
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