色譜手動積分指南

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色譜積分方法，最近幾年控制的比較嚴格，部分規定任何的積分方法修改都要經過批准。而手動積分又是實驗室經常面臨的問題，所以，何時可以手動積分？如何進行手動積分？這些一直以來都是色譜分析工作者最頭疼的問題，今天就和大家一起啃掉這塊「硬骨頭」。

指在信號中確定峰並計算其大小，積分包括以下操作及步驟：識別、校正、定量。

對於某個信號進行積分時，軟體將識別每個峰的開始和結束時間，並用豎線標記這些點，尋找每個峰的峰頂點，確定保留時間/遷移時間，建立基線，以及計算每個峰的峰面積、峰高和峰寬。這些過程積分事件的參數控制。

自動積分功能為設置初始事件提供開始點。自動積分功能設置以下參數：初始斜率靈敏度（閾值）、初始峰高、初始峰寬、初始最小峰面積。

此類型的積分允許對選定的峰或峰組進行積分，在指定的手動積分範圍內，將忽略此軟體的事件積分（初始最小峰面積除外）。如果手動積分出來的一個或多個峰低於最小峰面積閾值，則此積分將被廢棄。手動積分時間使用絕對時間值。它們不會為信號漂移作調整。

在報告中，手動積分提供以下功能：

§ 劃基線：指定為一個峰或一組峰劃基線的位置；

§ 負峰：指定何時將基線以下的面積當作負峰處理；

§ 切線撇去：計算從主峰切線撇去的峰面積；

§ 分裂峰：指定用垂線分裂峰的點；

§刪除峰：從積分結果中刪除一個或多個峰。

自動積分主要是修改以下4個積分參數實現的，具體如下：

也稱閾值，指設置信號斜率的值，該斜率用於識別積分過程中峰的起點和終點。如何信號斜率大於「斜率靈敏度」值，將建立峰起點，如果信號斜率降到「斜率靈敏度」以下，將建立峰止點。

設置值越低，峰響應越靈敏，當然，不同品牌的儀器對設置值的響應程度會有所區別。

用於控制積分器的選擇性以區分峰與基線噪音。如果設置的初始峰寬太小，則可能將噪音當作峰。如果寬峰與窄峰混在一起，可以選用運行時間編程事件設定特定的峰寬。

根據峰面積來設置小於目標峰面積的峰將不被積分也不會報告；

最小目標峰的高度，任何小於最小峰高的峰將不被積分及報告。

1.低分離度或低響應；

2.流動相不穩定，基線紊亂，保留時間變化小； 

3.運行過程中，出現異常峰； 

4.軟體積分的局限性，如由於軟體參數閾值的設置導致峰未積分，峰起點和終點間出現肩峰和異常的基線漂移，軟體錯誤；

5.由於樣品母體的幹擾導致的複雜色譜圖，裂峰、目標雜質的同時洗脫/肩峰、基線噪音、負峰、基線上升或下降、峰的嚴重拖尾、烴類的存在導致自動積分不正確。

能進行手動積分嗎？答案是肯定的，可以進行手動積分，但手動積分必須在受控的情況下進行。一般情況下，應採用自動積分方式，不可以手動積分。特殊情況下，若是目標峰實在無法自動積分的，即對於採取高級積分的方式還不能將峰有效的積分，經申請與批准後，可以進行手動積分。

此外必須嚴格控制手動積分次數，因為如果一套好的分析方法，峰與峰之間分離較好，根本是不需要手動積分，如果需要手動積分的圖譜，分析方法必定不好。

單個雜質及總雜質的定量測定，選擇合適的閾值設置和合適的條件進行積分是很重要的。這種情況下，峰值可忽略通常設為0.05%。因此，數據採集系統的閾值設置至少相當於這個限制的一半（0.025%）。對任何未與主峰完全分離的雜質進行積分，最好採用峰谷對峰谷外推法(切向撇去法)。」

積分方法是否需要固定？個人認為應該分情況，分析方法驗證期間時積分參數摸索期，通過整套分析方法驗證過程來確定積分參數，這期間沒有修改積分參數之說，因為本身就沒有積分方法。放行檢測的積分方法可以先根據驗證情況進行確定，之後所有檢測的積分方法應該是固定，任何修改積分參數的行為應該進行申請，批准後方可修改。

穩定性考察為了反映雜質的趨勢，積分方法可以與放行方法不同，但不同時間點的積分方法應該相同，任何修改，同樣需要申請及批准。

目前的色譜系統，均有審計追蹤，當我們對積分方法進行修改時，均會出現「comment」，要求輸入具體的修改內容。

1.色譜軟體使用動態尋峰算法和自動尋峰算法。

2.通常建議先用軟體積分色譜來處理像峰寬、閾值、峰高及峰面積等需要積分的情形。

3.因為一些固有的或分析變化以及基線漂移的原因，自動積分將會有偏差，從而進行手動積分。

圖 6.3.7-1表示標準品和某濃度下的樣品通過同樣的積分事件進行積分，並一同呈現在同一色譜圖中。對小峰、接近峰、負峰、漂移峰以及峰谷進行積分需要時間和技巧。不推薦手動積分，且應儘可能避免進行手動積分。

圖 6.3.7-2 是一個模型色譜圖，它同時展現了手動積分峰和軟體積分峰。

列印出的色譜圖應以可見比例形式呈現各個分析項需要的內容，如對於含量和單個分析項，峰頂應可見；對於純度分析，峰基應可見。

圖 6.3.7-3以一個有著適當比例和可見的色圖譜來說明適當的積分。行業內通常的做法是為多組分分析提供清晰可見的基線，而為單峰分析提供整個色譜峰。

圖 6.3.7-4a是一張以最大比例列印的色譜圖，其中峰值積分並不可見。Figure 6.3.7-4b是同樣的色譜圖以適當的比例列印，其中可以看到峰值修正和缺失峰的積分，揭示了手動積分操作。

含量溶出度以及含量均一性包含了對單一分析物/峰按照已知標準進行計算的分析項目。在這些類型的分析項目中，都期望其具有準確和精確的系統適應性特徵的高斯峰。正常的高斯峰應該確切地從色譜峰起始位置開始積分到截止為止結束積分。圖 6.3.7-5a-5f 展現了這些類型測試代表性的峰積分。

圖 6.3.7-5a是單組分分析的未處理的信號峰。圖 6.3.7-5b表示的是對原始數據以適當的積分事件進行積分並以可見的比例呈現。圖 6.3.7-5c 表示的是通過修整積分而產生了低面積的峰。圖 6.3.7-5d表示的是對原始數據用不適當的積分事件進行積分會表達更多的面積。

在這些圖示中，所有的積分都是通過調整色譜軟體的積分事件來完成的。色譜軟體會標示出哪些峰是手動積分的。實驗室應該有適當的控制措施以檢測應用了錯誤的積分事件而造成的數據損毀。

Figure 6.7.7-6a-6c 和Figure 6.7.7-7a-7c展示的是成分分析/色譜純度分析這種多組分分析（峰組）中的發生的積分錯誤。這兩種情況下，報告的峰面積都會減少。

1.手動積分不能試圖通過以下動作來使數據符合標準要求：減少峰（減少峰面積）、增加峰（增加峰面積）、改變峰高；

 

2.同一次檢驗的所有標準品、對照品、樣品等必須使用同一方法進行手動積分；

 

3.手動積分結束後，應列印自動積分圖譜和手動積分圖譜附於手動積分申請表之後，提交QC經理審核；

 

3.自動積分的圖譜不得刪除或被覆蓋，應與手動積分圖譜保存於計算機中，列印的自動積分圖譜和手動積分圖譜應標識清楚籤名，隨同手動積分申請表附於檢驗原始記錄後面一起交質量管理部經理、QP審核無問題後歸檔。

 

4.研發和生物實驗室可能需要手動積分。儘管對於QC實驗室，手動積分可能僅在特殊情況下是必需的或可接受的；但手動積分還是不適合應用於分析檢測實驗室。手動積分只有在得到主管書面批准且結果正確記錄後，根據批准程序才能進行，而不應該由分析師自行決定。

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