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最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上研究論文，名為"Structures of human antibodies bound to SARS-CoV-2 spike reveal common epitopes and recurrent features of antibodies"。研究從結構上定義了源自VH3-53/VH3-66的復現型SARS-CoV-2抗體，揭示了該抗體與SARS-CoV VH3-30抗體的相似性，為評估疫苗誘導的抗體提供了標準。
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摘要
中和抗體對新冠病毒的反應主要針對三聚體刺突的受體結合域（RBD）。在此，我們對COVID-19恢復期個體的多克隆IgGs和Fabs識別冠狀病毒刺突的過程進行了表徵。血漿IgGs在多個方面存在差異，例如對RBD表位的靶向、對α-冠狀病毒和β-冠狀病毒的識別，以及在IgGs或Fabs結合/中和病毒過程中的親和力效應強弱等等。利用電子顯微鏡，我們探究了多克隆血漿Fabs的特異性，顯示了其對SARS-CoV-2刺突上S1A結構域和RBD表位的識別。此外，中和性單克隆Fab-刺突複合物的3.4Å冷凍電鏡結構顯示出一個阻礙ACE2受體結合的表位。基於這些結構的建模分析表明，IgGs在病毒上的刺突間交聯表現出不同的可能性，而且具有這些特性的IgGs不會受到SARS-CoV-2刺突突變的影響。總的來說，我們的研究從結構上定義了源自VH3-53/VH3-66的復現型SARS-CoV-2抗體，揭示了該抗體與SARS-CoV VH3-30抗體的相似性，為評估疫苗誘導的抗體提供了標準。
簡介
SARS-CoV-2是呼吸系統疾病COVID-19的病原體，於2020年引發了一場大流行。SARS-CoV-2是繼2003年SARS-CoV和2012年MERS-CoV（中東呼吸症候群）感染之後，本世紀出現的第三種感染人類的人畜共患型β-冠狀病毒。目前有四種呈全球分布的人類冠狀病毒，分別為HCoV-OC43、HCoV-HKU1（β-冠狀病毒）、HCoV-NL63和HCoV-229E（α-冠狀病毒），由這些病毒引起的普通感冒佔比15-30%。中和抗體對冠狀病毒作出的反應主要針對病毒包膜上的三聚體刺突糖蛋白，這也是病毒和宿主細胞膜融合的關鍵。冠狀病毒S蛋白有三個S1亞基，包括S1A到S1D結構域，介導病毒與靶細胞之間的連接；同時存在三個S2亞基，具有融合肽和膜融合功能。抗SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白的中和抗體反應通常靶向受體結合域（RBD，也被稱為S1B域）。
SARS-CoV-2（含1273個殘基，菌株Wuhan-Hu-1）和SARS-CoV（含1255個殘基，菌株Urbani）的S蛋白胺基酸序列同源性高達77.5%，而SARS-CoV-2和MERS-CoV（含1353個殘基，菌株EMC2012）的S蛋白親緣關係較遠，同源比例僅為31%。SARS-CoV-2和普通感冒冠狀病毒S蛋白的序列特徵相似性更低，僅為25~30%。系統發育分析證實，與其他人類冠狀病毒相比，SARS-CoV-2和SARS-CoV之間的親緣關係更為密切。RBD/S1B結構域顯示出不同程度的序列特徵一致性，其範圍從SARS-CoV-2與HCoV-NL63相比的13%，至SARS-CoV-2和SARS-CoV相比的74%。然而，S蛋白三聚體外結構域的三維結構彼此相似，也與其他冠狀病毒的S蛋白結構類似。既往研究還發現RBDs（S1B結構域）具有較強的可變性，可以呈現出「向上」的構象，也可以呈封閉的預融合三聚體「向下」構象。SARS-CoV-2和SARS-CoV的基礎胺基酸序列與MERS-CoV的序列存在差異，這導致病毒與不同的宿主受體結合：SARS-CoV-2和SARS-CoV結合血管緊張素轉換酶2（ACE2），而MERS-CoV結合二肽基肽酶4。一種常見的感冒冠狀病毒HCoVNL63也通過其RBD（S1B）結合ACE2，雖然這種作用與SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD-ACE2相互作用在結構上有所不同，而HCoV-OC43和HCoV-HKU1則通過S1A域結合包括9-O-乙醯唾液酸在內的宿主受體。
了解抗體對SARS-CoV-2 S蛋白的反應十分重要，因為疫苗保護的相關因素通常與抗體聯繫緊密此外，研究人員正考慮以抗體作為COVID-19患者的治療手段。與其他冠狀病毒S蛋白相比，我們對SARS-CoV-2 S蛋白的抗體識別知之甚少。然而，了解SARS-CoV-2和其他冠狀病毒的S蛋白三聚體、RBD-Fab、RBD-ACE2，以及S蛋白三聚體-Fab複合物的結構有助於解釋和理解抗體對SARS-CoV-2作出的反應。
在此，我們從10位COVID-19恢復期個體的血漿中提取出了經過純化的IgG和Fabs並進行了分析，使其結合6種人類冠狀病毒的三聚體S蛋白和單體RBD/S1B域，並中和SARS-CoV-2假病毒。為了更好地了解多克隆抗體識別病毒的特徵，我們進一步使用負染色電子顯微鏡多克隆表位圖（nsEMPEM）表徵了兩個個體的血漿Fabs，表明多克隆圖譜包括靶向SARS-CoV-2 S1A和RBD域中表位特異性抗體。此外，我們得到了S蛋白三聚體與中和單克隆抗體（mAb）結合的3.4 Å單粒子冷凍電鏡結構，mAb靶向一個呈「向上」構象的RBD表位，該表位與nsEMPEM發現的RBD表位重疊，而且會在空間上阻礙ACE2受體結合。我們發現的表位代表著由不同的VH基因片段定義的結合類型，提示這些重複出現的結合類型在針對SARS-CoV-2的中和抗體中具有普遍性。我們的發現為評估因病毒感染或接種疫苗產生的中和抗體提供了標準。最後，我們的建模分析顯示，不同的結合方向會導致親和力差異效應，這表明刺突間交聯可能會增強某些抗S蛋白IgGs對SARS-CoV-2病毒體的有效親和力。
結果
恢復期血漿IgG和Fab的結合特性顯示出對不同冠狀病毒的識別和親和力效應。本研究所用的恢復期血漿樣本來源於洛克菲勒大學醫院的COVID-19患者。我們從10位恢復期患者的血漿中分離出多克隆IgGs，其中大部分具有較高的中和效價，隨後，我們使用ELISA比較這些IgGs分別與來自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-229E的純化S蛋白的結合。研究發現，純化的血漿IgGs能識別本研究中所有冠狀病毒的S蛋白，大多數樣本與MERS-CoV和普通感冒冠狀病毒S蛋白的結合較弱。根據ELISA EC50值及抗體中和的能力，血漿COV21、COV57和COV107被選為進一步分析的樣本。分析表明，來源於COV21和COV57的IgGs與SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白結合最強。只有COV57 IgGs與MERS-CoV S蛋白的結合可被測量。COV107 IgGs與SARS-CoV-2和SARS-CoV的結合程度中等，但不結合MERS-CoV S蛋白。
為了評估交叉反應識別在多大程度上促進了血漿IgGs與RBD/S1B結構域的結合，我們使5個血漿IgG樣本分別吸附SARS-CoV-2 RBD偶聯樹脂或對照組樹脂，在吸附前後重複了ELISA過程。作為陽性對照，與RBD樹脂共同培養的純化血漿IgGs很少或不與SARS-CoV-2 RBD結合。SARS-CoV-2 RBD吸附後殘留的IgGs與SARS-CoV RBD的結合也出現了相應的減少，表明SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD具有結構同源性。相比之下，血漿IgGs對SARS-CoV-2 RBD樹脂的吸附僅對普通感冒冠狀病毒RBD的結合只產生了中度影響，這符合交叉反應抗體識別很少或沒有的結果，其原因很可能與SARS-CoV-2 RBD和輕度冠狀病毒RBDs之間的保守序列重疊較少有關。
綜上所述，我們的研究結果表明：（i）不同的冠狀病毒S蛋白進行識別的結合強度和模式在各個COVID-19個體血漿樣本之間存在差異；（ii）處於COVID-19恢復期的個體體內存在抗SARS-CoV-2 S蛋白的抗體，其次也存在靶向RBD/S1B的抗體，並且對其他冠狀病毒具有活性，這很可能是因為患者此前曾經接觸過普通感冒病毒；（iii）患者血漿樣本中的多克隆IgGs與來自MERS-CoV和/或SARS-CoV的S蛋白結合後可能表現出交叉反應識別，因為血漿捐獻者不太可能感染這些冠狀病毒；（iv）與COV57和COV107血漿相比，COV21 IgG產生的反應在所有識別SARS-CoV-2 RBD的IgG中所佔比例更高。
通過比較二價多克隆IgGs與病毒刺突的結合及單價Fabs（由純化的多克隆IgGs經過蛋白水解後製備而成）的結合，我們進一步評估了親和力效應對血漿IgGs與S蛋白和RBDs結合強度的影響程度。ELISA數據表明，血漿樣品中的IgGs對S蛋白RBD/S1B結構域中表位的關注程度不同，它們與SARS-CoV、MERS-CoV和普通感冒冠狀病毒的相對反應量也不同；而且，親和力效應在更大程度上影響了多克隆二價IgG的結合，使其與單價Fabs相比產生了更為緊密的結合。
血漿IgGs是比血漿Fabs更強大的中和劑。為了探究二價結構或比Fabs更大的IgGs是否具有更強的中和效力，我們使用體外中和測定法評估了純化血漿IgGs和Fabs的效力。研究發現，與單價Fabs相比，二價IgGs可以更有效地中和SARS-CoV-2假病毒。
已發現的 S 突變不太可能影響nsEMPEM和單粒子冷凍電鏡揭示的表位。最近一項研究表明，S蛋白（D614G）突變增加了SARS-CoV-2的可傳播性，並推測這種替代突變或是在不同S蛋白序列中發現的其他突變可能會影響抗體識別。為了確定D614G突變是否會影響抗體的結合，我們在COV21和COV57 nsEMPEM重建和C105-S冷凍電鏡結構上標記了D614殘基和其他殘基的位置，這些殘基是此前研究報導的突變位點。我們發現，結合RBD的COV21 Fab和C105 Fab與D614殘基相距甚遠。因此，如果COV21重建結構反映了COV21血漿中的主要表位，那麼COV21個體產生的抗體不太可能受到D614G替代突變的影響。所以，如果沒有由突變引起的重大構象變化，那麼實驗中觀察到的替代突變（尤其是D614G突變）不太可能影響COV21或COV57個體產生的抗體或結合RBD的mAbs。
S蛋白表位在IgG和受體結合期間體現出的親和力效應指向不同的可能性。IgGs包含兩個相同的抗原結合Fabs，可以通過親和力效應使病原體與間隔均勻的抗原位點相結合，無論其結合方式是刺突間交聯（IgGs在相鄰的刺突上結合相同的表位）還是刺突內交聯（結合單個多面體刺突中兩個相同亞基的同一表位）。
為了探究抗SARS-CoV-2 IgGs是否可能發生刺突間交聯，我們對病毒體包膜上相鄰的S蛋白進行了建模。根據SARS-CoV和其他冠狀病毒的冷凍電子斷層掃描分析結果，我們假設最小的刺突間分隔距離約為15 nm。建模分析預測，COV21表位可能發生刺突間交聯。相比之下，COV57-S蛋白nSEMPEM重建結構中的呈「向下」構象的Fab似乎不太可能參與IgGs的刺突間交聯。這些預測與ELISA的結果一致，表明COV21 Fabs的結合與 IgG對應物相比較弱，但對於CoV57而言，Fab與IgG比較的差異不太明顯。
我們還使用了建模分析來預測親和力效應是否會影響ACE2與病毒S蛋白三聚體之間的相互作用。假設宿主細胞膜中有鄰近的ACE2-BOAT1複合物，該模型預測刺突間交聯是有可能實現的。此外，如果位於兩個呈「向上」構象/一個「向下」構象的三聚體中的RBDs都能旋轉，則刺突內交聯也可能會發生。因此，如果S蛋白三聚體確實可以交聯鄰近的ACE2受體，或以單個三聚體的形式結合ACE2二聚體的兩個亞基，那麼它們就可以利用親和力效應，產生比親和力測量預測的更緊密的結合，包括單體ACE2胞外結構域與單體冠狀病毒RBDs的相互作用。
SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2二聚體相互作用期間的親和力效應可以表現出不同的可能性，這對解釋假病毒分析的結果意義重大，有助於估計在存在或缺乏潛在抑制劑（如抗體）時冠狀病毒的傳染性。SARS-CoV-2的體外中和試驗包括基於HIV慢病毒顆粒的假病毒、小鼠白血病病毒逆轉錄病毒顆粒，以及水皰性口炎病毒。每一種假病毒都可能包含不同數量的刺突，在這種情況下，刺突的總體密度將改變對抗體親和力的敏感性。在任何情況下，親和力對IgG與抗原結合的影響都十分複雜，其影響因素包括Fab-抗原結合的固有親和力、動力學、初始濃度和培養時間。因此，在體外中和試驗中，某些IgGs的中和能力可能會受到影響，但不是所有的IgGs。此外，在考慮將恢復期血漿或純化抗體應用於治療時，由於抗體濃度、病毒滴度的不確定性，以及感染性病毒體上S蛋白三聚體間隔和密度的不同，因此對於親和力效應的預測將十分困難。
討論
本研究的結果讓我們了解了在COVID-19恢復期個體中和性血漿中多種多樣的抗體反應。我們從結構上表徵了多克隆血漿IgGs，發現該類抗體與SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白結合可表現出不同程度的交叉反應。本研究還顯示，COVID-19恢復期個體的血漿IgGs中還包含針對普通感冒病毒RBDs的非交叉反應抗體。
通過繪製恢復期血漿IgGs靶向的SARS-CoV-2 S蛋白表位圖，我們不僅觀察到了抗體對S蛋白RBD、S1A結構域的預期靶向，也發現了一個RBD之外的表位，即潛在的中和抗體替代結合位點。來自COV21血漿的Fab在結合RBD時類似於S230的結合，而S230是一種從SARS-CoV患者體內分離出的VH3-30 mAb，可阻止與ACE2受體的結合。
我們在分析來自COV107個體的單克隆中和抗體時，發現了另一種可阻斷ACE2受體結合的抗SARS-CoV-2抗體。在SARS-CoV-2 S蛋白與C105單克隆抗體結合的3.4Å電鏡結構中，我們觀察到RBD上的一個表位與COV21 Fab的結合位點重疊，與從COVID-19患者體內分離的另一種單克隆抗體B38的結合非常相似。與C105一樣，B38也源於VH3-53 VH基因片段。我們的結構研究支持以下假設：來源於VH3-53/VH3-66和VH3-30基因片段的復現型抗SARS-CoV-2中和抗體使用不同的RBD-結合模式，分別由B38/C105和S230單克隆抗體的結合所代表。本研究為評估因病毒感染或僅針對特定序列的疫苗接種而產生的抗體提供了富有價值的信息。最後，我們採用nsEMPEM和單粒子冷凍電鏡繪製了RBD和S1A表位圖譜，證明了這些表位不太可能受到不同SARS-CoV-2分離物的常見突變影響，這為可能有效對抗當前大流行的抗體治療和/或疫苗提供了希望。
相關論文信息
原文刊載於CellPress細胞出版社旗下期刊Cell上
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▌論文標題：
Structures of human antibodies bound to SARS-CoV-2 spike reveal common epitopes and recurrent features of antibodies
▌論文網址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30757-1
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.025
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